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Jan 09, 2024

Flujo de trabajo de gradiente a seccionamiento CUBE para la generación e imagen de organoides con diferenciación localizada

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 299 (2023) Citar este artículo

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Los avances en el cultivo de organoides han dado lugar a varios miniórganos in vitro que imitan los tejidos nativos de muchas maneras. Sin embargo, el cuello de botella sigue siendo generar organoides complejos con patrones de ejes corporales, así como mantener la orientación de los organoides durante los procesos de análisis posteriores al experimento. Aquí, presentamos un flujo de trabajo para cultivar organoides con gradiente de morfógeno utilizando un dispositivo de cultivo CUBE, seguido de muestras de corte con CUBE para retener información sobre la dirección del gradiente. Mostramos que los esferoides hiPSC cultivados con dos medios de diferenciación separados en los extremos opuestos del CUBO dieron como resultado expresiones localizadas de los respectivos marcadores de diferenciación, en contraste con la distribución homogénea de marcadores en los controles. También describimos los procesos para el seccionamiento criogénico y de parafina de esferoides en CUBE para retener la información de orientación del gradiente. Este flujo de trabajo desde el cultivo en gradiente hasta el corte con CUBE puede proporcionar a los investigadores una herramienta conveniente para generar organoides cada vez más complejos y estudiar sus procesos de desarrollo in vitro.

Las células madre pluripotentes (PSC) y los organoides derivados de ellas ofrecen una forma pragmática de modelar y estudiar la formación de tejidos y órganos durante el desarrollo humano temprano, ya que los especímenes reales plantean cuestiones éticas desafiantes1,2,3,4. Los protocolos para generar los diversos organoides que imitan los tejidos nativos generalmente se basan en la manipulación secuencial de la activación o inhibición de vías de señalización como Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt o BMP en diferentes momentos para inducir la diferenciación hacia linajes específicos, como en el generación de organoides de intestino5, riñón6 y pulmón7, epiblastos8,9 y gastruloides10.

Sin embargo, controlar el crecimiento y la diferenciación de células a lo largo de un eje corporal sigue siendo un desafío en cultivos de organoides 3D. Los patrones in vitro, anterior-posterior y dorso-ventral en los organoides pueden surgir por autoorganización celular11,12, o lograrse mediante la fusión de organoides diferenciados por separado como un ensamble, como en los organoides cerebrales con diferentes regiones del cerebro o los organoides biliares con organoides hepáticos, biliares. componentes del tracto y del páncreas13,14. La limitación con estos métodos, sin embargo, es que debido a que las células se cultivan en un solo medio uniforme, el nivel de control en términos de información espacial suministrada a las células es bastante bajo; todas las células dentro del grupo de células que componen el organoide reciben las mismas señales de diferenciación de las moléculas de señalización en el medio. In vivo, por otro lado, los gradientes de concentración de morfógenos de otras fuentes también contribuyen a determinar dónde van las células y qué fenotipo o patrón deben adoptar durante el desarrollo15,16. Por ejemplo, la formación del tubo neural depende de las señales de la notocorda y la capa del ectodermo no neural17, y las nefronas del riñón se desarrollan mediante el intercambio de varias señales entre la yema ureteral y el mesénquima metanéfrico18. Por lo tanto, existe la necesidad de replicar los gradientes de morfógenos para generar organoides que se parezcan más a los tejidos nativos in vivo.

Se han desarrollado varias tecnologías de ingeniería para imitar el suministro de un gradiente espacial de moléculas de señalización a las células in vitro. Las PSC diseñadas para expresar Sonic Hedgehog (Shh)19 o perlas de agarosa empapadas con morfógenos20 se pueden colocar cerca del organoide en desarrollo y la difusión de moléculas desde la fuente hasta las células diferenciadas creó un gradiente de concentración de morfógenos de alto a bajo. Además, también se han desarrollado varios transwells y microdispositivos modificados que permiten cultivar células con dos compartimentos de medios separados para generar gradientes de morfógeno en direcciones opuestas a través de las células21,22,23,24,25,26. Sin embargo, estas tecnologías no están exentas de inconvenientes: (1) requieren procedimientos complicados de preparación y configuración que no son fáciles de realizar en la mayoría de los laboratorios de biología sin habilidades y equipos especializados, (2) carecen de control sobre la colocación y el posicionamiento del muestra en el dispositivo, y (3) es difícil recuperar la muestra del dispositivo después del experimento para análisis posteriores sin causar mucho daño a la muestra o perder la orientación de la muestra. En particular, la capacidad de retener información sobre la orientación del gradiente al que estaban sujetas las células es fundamental para garantizar un análisis adecuado de la muestra.

Por lo tanto, nuestro objetivo fue abordar estos problemas mediante el desarrollo de una plataforma de cultivo de gradientes simple y fácil de usar para controlar la diferenciación de PSC en organoides con distintos patrones localizados, al tiempo que conservamos la integridad de la muestra y la orientación del gradiente para los procesos de análisis de imágenes. Para lograr esto, utilizamos un dispositivo de cultivo CUBE desarrollado previamente para mejorar la capacidad de manejo de las muestras cultivadas en hidrogel ECM y la repetibilidad de la siembra celular y la formación de patrones27,28. Debido a la simplicidad del dispositivo CUBE que consta de un marco de material duro simple con paredes transparentes que permiten ver la muestra en su interior, el diseño y la composición del CUBE se pueden adaptar fácilmente para adaptarse a los requisitos del experimento. Por ejemplo, en este estudio, el diseño del marco se modificó para garantizar la hermeticidad integrada con un dispositivo fluídico, y el material del marco se eligió para que fuera compatible con los reactivos orgánicos utilizados en el procesamiento de muestras posterior al experimento. Aquí, primero mostramos cómo podemos colocar con precisión esferoides de células iPSC en la posición deseada en el CUBO. Luego, demostramos la facilidad con la que se puede generar un gradiente en el CUBE para inducir la diferenciación localizada de iPSC simplemente transfiriéndolo a un dispositivo de chip de gradiente de dos compartimentos sin la necesidad de configurar sistemas de bomba complicados. Por último, presentamos la compatibilidad de la plataforma de gradientes con diferentes métodos de procesamiento posteriores al experimento (secciones criogénicas y de parafina) para obtener imágenes y análisis manteniendo la información de orientación del gradiente (Fig. 1). Con este flujo de trabajo Gradient-in-CUBE, se pueden lograr organoides con diferenciación controlada del eje del cuerpo, proporcionando modelos in vitro cada vez más complejos en los que podemos aplicar y estudiar sistemáticamente los efectos de los gradientes de morfógenos para dirigir la diferenciación y el desarrollo celular en tejidos, órganos, y, finalmente, los sistemas del cuerpo para ampliar nuestra comprensión de los procesos de desarrollo en humanos.

El concepto de este trabajo fue utilizar el dispositivo de cultivo CUBE para, en primer lugar, controlar la posición de siembra de las células en la ubicación deseada, luego transferir el CUBE a un chip Gradient-in-CUBE para cultivar células con un gradiente de morfógeno y, finalmente, seccione la muestra con el CUBO para mantener la información de orientación del gradiente en las secciones.

Los gradientes de señalización de morfógenos contribuyen a la especificación y el patrón del destino celular en los tejidos en desarrollo29, y la recapitulación de este fenómeno in vitro podría promover el desarrollo de modelos de organoides cada vez más complejos. Sin embargo, la diferenciación por señales de gradiente es difícil de lograr en organoides que se cultivan en un solo medio uniforme en una placa de pocillos y se basan principalmente en la autoorganización para la creación de patrones30. Aunque ha habido muchos informes sobre métodos para cultivar organoides con gradientes de morfógenos 19,20,31, la configuración complicada y la mala capacidad de manejo de muestras, así como el mantenimiento de la orientación del gradiente durante el análisis, limitan su adopción generalizada por parte de la comunidad de organoides. Al aprovechar la facilidad de manejo del dispositivo CUBE, establecimos un flujo de trabajo desde el cultivo de organoides con gradiente de morfógeno hasta muestras de imágenes con orientación de gradiente, con los siguientes procesos: (1) controlar la posición de siembra inicial de las células en el CUBE que permite células para recibir información de gradiente constante en cada experimento, (2) generar un gradiente de señalización de morfógenos a lo largo de un eje de la muestra celular y (3) seccionar la muestra con el CUBO para retener información de la dirección del gradiente.

La ubicación precisa de las células en el CUBO es importante para garantizar la coherencia en la señalización de gradiente que reciben las células. Por ejemplo, la información de gradiente detectada por las celdas que se colocaron demasiado cerca de un extremo del CUBO será diferente de la detectada por las celdas en el centro del CUBO. Para controlar la posición de siembra de las células en CUBE, una tapa de molde con una estructura de pilar para crear un bolsillo de siembra en la posición deseada en el hidrogel en CUBE, así como ranuras para garantizar el ajuste preciso de la tapa de molde en CUBE fue diseñado (Fig. 2b(i)). El proceso para hacer un bolsillo de siembra y esferoides de células de siembra en el bolsillo se ilustra en la Fig. 2b (ii) y se describe en la sección de métodos. Al utilizar este método de siembra, las celdas siempre se pueden sembrar en la ubicación deseada con poca variación, en comparación con el posicionamiento manual de las celdas sin una guía, lo que da como resultado una siembra imprecisa con una gran variación (Fig. 1 complementaria). Aunque se podría argumentar que una persona altamente capacitada o un robot pueden colocar células en el gel sin curar con gran precisión sin necesidad de la tapa del molde, el comportamiento de gelificación de los hidrogeles blandos como el colágeno o el Matrigel puede variar mucho según depende de la temperatura y la manipulación de la muestra, y es difícil predecir cuándo el gel se habrá polimerizado lo suficiente como para mantener las células en posición. Para resaltar la facilidad con la que cualquier persona puede utilizar este método, reclutamos a nuestra secretaria de laboratorio y a un estudiante de secundaria, quienes no tenían experiencia con el uso del CUBO o la tapa del molde, para realizar el mismo experimento. Con una capacitación mínima, ambos lograron sembrar con una precisión similar a la de un usuario experimentado y con una precisión significativamente mayor en comparación con un usuario experimentado sin la tapa del molde (Figura complementaria 1).

un proceso de fabricación de CUBE (i) Diseños de CUBE para cortes en parafina y criogénicos. (ii) Proceso para adherir las paredes laterales de PDMS al dispositivo CUBE. b Proceso de siembra de células (i) Diseño de la tapa del molde. (ii) Procese para sembrar células en el bolsillo de siembra creado por la tapa del molde en el hidrogel en el CUBO. c Proceso de fabricación Gradient-in-CUBE (i) Diseños de moldes para fabricar la tapa y la base del chip. (ii) Proceso para fabricar chips de PDMS a partir de moldes y adherir la tapa a la base mediante NSD, un sello adhesivo de PDMS de doble cara. d Seccionamiento para imágenes. (i) Proceso para incrustar muestras en medio criogénico y seccionamiento con CUBE. (ii) Procese para incrustar muestras en parafina con soporte CUBE, luego seccione con un borde marcado para mantener la orientación de la muestra.

Para establecer un gradiente a lo largo del CUBE, se diseñó y fabricó un chip Gradient-in-CUBE, que comprende un componente base y un componente de tapa, mediante un proceso de moldeo. El molde para la base contenía un compartimento para el CUBO y dos cámaras de medios separadas, así como una ranura para colocar la junta tórica; el molde para la tapa tiene dos puertos para agregar medios a las dos cámaras de medios separadas (Fig. 2c(i)). Los procesos para fabricar el chip se ilustran en la Fig. 2c (ii), (iii) y se describen en la sección de métodos, con una Película complementaria 1 que muestra cómo se integra el CUBO con el chip.

Se usaron FITC-dextrano y TRITC-dextrano para simular la adición de dos tipos diferentes de medios al CUBE, y se realizaron imágenes diarias para monitorear el progreso de la formación de gradiente dual en el CUBE durante un período de 5 días (Fig. 3a ). Se midió la concentración promedio (C) de FITC y TRITC en la región central de la ventana del CUBO (x – x'), y mostró un gradiente opuesto de alta concentración en el lado de la fuente a menor concentración en el lado del sumidero, como las respectivas moléculas de dextrano se mueven desde el lado donde está altamente concentrado, al lado opuesto donde la concentración es mucho menor (Fig. 3b). Se agregaron 10 μM de dextrano al depósito fuente y la concentración máxima promedio en el extremo fuente del FOV fue FITC = 2,618 μM y TRITC = 3,255 μM, mientras que la concentración mínima en el extremo receptor fue FITC = 0,024 μM y TRITC = 0,026 µM. El gradiente se calculó como la relación de Ix0.2/Ix2.0 para FITC e Ix2.0/Ix0.2 para TRITC, donde un valor de uno no muestra gradiente y una relación más alta representa un gradiente más pronunciado (Fig. 3c). La inclinación del gradiente aumenta y alcanza su punto máximo durante las primeras 24 horas a medida que las moléculas comienzan a entrar en el gel, pero a medida que las moléculas se acumulan en el lado opuesto y en el gel del CUBO, la inclinación del gradiente disminuye hacia el día 2 Sin embargo, con un enjuague diario con DPBS y reemplazo con dextrano nuevo, se puede mantener un gradiente constante durante 5 días sin que el medio alcance un estado de equilibrio. En este estudio, solo se utilizó la difusión de dextrano de 40 kDa en un gel de agarosa para modelar la difusión de factores de crecimiento en un hidrogel ECM. Estos se eligieron sobre la base de que el peso molecular de Wnt, que desempeña un importante papel de señalización en el desarrollo, es de aproximadamente 40 kDa, y que el dextrano y la agarosa son reactivos fácilmente disponibles que se han utilizado en numerosos estudios de difusión y transporte de masas. Debido a la gran cantidad de gradientes de morfógenos conocidos con diferentes pesos moleculares y la gran variedad de hidrogeles disponibles para usar en cultivos celulares, no fue plausible investigar las diversas permutaciones de parejas de morfógenos e hidrogeles en el presente estudio.

a Imágenes del gradiente FITC- y TRITC-dextrano que se forma durante un período de cinco días. La formación de imágenes se realizó cada 24 horas después de que se eliminó el dextrano usado, la cámara de medios se lavó con DPBS y se agregó dextrano fresco a la cámara. Las dimensiones de la ventana del CUBO fueron w = 2,75 mm; h = 3,5 mm y el campo de visión de la imagen con un aumento de 4x fue w = 3,6 mm; altura = 2,7 mm. Barra de escala = 1 mm. b La concentración, C se determinó correlacionando linealmente la intensidad promedio a lo largo del eje y para cada píxel en la región central (w = 2,2 mm; h = 2,2 mm) de la imagen de fluorescencia de x a x' con la obtenida de un estándar ajuste de curvas de concentraciones de FITC- y TRITC-dextrano. Barra de escala = 1 mm. Los marcadores representan puntos de datos seleccionados cada 50 píxeles (~0,3 mm), y las líneas muestran el mejor ajuste de mínimos cuadrados lineales; n = 5. Las pendientes de las líneas individuales para FITC fueron −0,0044 para el día 0, −0,5586 para el día 1, −0,5607 para el día 2, −0,5549 para el día 3, −0,5487 para el día 4 y −0,5391 para el día 5. Para TRITC, las pendientes fueron 0,0095 para el día 0, 0,7644 para el día 1, 0,7062 para el día 2, 0,6504 para el día 3, 0,5897 para el día 4 y 0,6039 para el día 5. El día 0 muestra un pequeño gradiente, pero para el día 1 se observa un gradiente de concentración. generado desde un extremo del CUBO al extremo opuesto para FITC y TRITC, respectivamente, en la dirección opuesta. c La relación entre la concentración en el extremo de la fuente y la concentración en el extremo del sumidero se tomó como una representación de la inclinación del gradiente. El área analizada fue desde x = 0,2 mm hasta x = 2,0 mm como región aproximada en la que se ubicaría el esferoide. El gradiente fue más pronunciado el día 1, pero aunque disminuyó a partir del día 2, se puede mantener un gradiente constante durante cinco días. d La diferenciación del esferoide hiPSC con medio inductor de mesodermo (M) en un lado y medio inductor de neuroectodermo (NE) en el lado opuesto da como resultado un esferoide con morfología diferente en cada extremo del esferoide, mientras que la morfología es relativamente uniforme en M o NE sólo controles. Barra de escala = 500 μm.

Dado que un gradiente a lo largo de una escala de una sola o unas pocas celdas de longitud es suficiente para proporcionar información posicional a las celdas32,33, postulamos que el gradiente generado en el chip Gradient-in-CUBE debería ser suficiente para inducir la diferenciación localizada en el lado opuesto. extremos de un esferoide. Además, otra estrategia para contrarrestar la acumulación de morfógeno es complementar los inhibidores del morfógeno en el lado opuesto del gradiente, ya que la interacción entre el morfógeno y su inhibidor también es fundamental para el patrón en los tejidos in vivo. Por ejemplo, los antagonistas de Wnt y Nodal Dkk1, Lefty-1 y Cer-1 en las partes anteriores del embrión restringen Wnt/Nodal al extremo posterior del embrión para establecer el eje anterior-posterior34.

Para demostrar la aplicación del chip Gradient-in-CUBE para diferenciar un solo esferoide en dos regiones localizadas, suministramos un medio de diferenciación de neuroectodermo (NE) en un extremo del CUBO y un medio de diferenciación de mesodermo (M) en el lado opuesto. El medio de mesodermo (basado en un protocolo de Lam et al.35) contenía altas concentraciones de activador de Wnt CHIR99021, mientras que el medio de neuroectodermo (basado en un protocolo de Bianchi et al.36) contenía un activador de Wnt más bajo junto con el inhibidor de Nodal/Activin SB431542 para contrarrestar la diferenciación del mesodermo en el lado del neuroectodermo. Después de 4 días de diferenciación, se pudieron observar diferencias morfológicas en ambos extremos del esferoide, teniendo el lado del mesodermo una característica más protuberante y protuberante, en comparación con la característica más suave del lado del neuroectodermo. Por el contrario, los esferoides de control mostraron características morfológicas bastante uniformes: el control del mesodermo tenía protuberancias irregulares en toda la superficie; el control del neuroectodermo tenía una superficie más lisa (Fig. 3d).

A menudo es difícil visualizar la expresión de pluripotencia celular o marcadores de diferenciación en muestras 3D a mayor escala como organoides, debido al rango limitado de penetración del láser, así como a la baja sensibilidad de las lentes objetivas de bajo aumento y las distancias focales cortas de alta sensibilidad. lentes. Por lo tanto, los organoides a menudo se incrustan en medio criogénico o parafina y se cortan en secciones finas para la tinción y la obtención de imágenes. Sin embargo, la orientación de la muestra a menudo se pierde después de recuperar la muestra de los dispositivos generadores de gradiente predominantes. Las ventajas del dispositivo CUBE no son solo que las celdas están contenidas dentro del CUBE y se pueden recuperar sin dañar la muestra, sino también que la orientación del gradiente se puede marcar fácilmente para reconocerla más tarde. Aquí mostramos que las muestras en el CUBE se pueden procesar para crio y seccionamiento en parafina.

Para el corte criogénico, el marco más grueso en un extremo del CUBO donde se adjuntó la junta tórica actúa como un marcador de orientación. Después de recuperar la muestra del chip Gradient-in-CUBE, el CUBE simplemente se puede sumergir en sacarosa y medio de inclusión criogénico antes de congelarlo. Una vez congelado, el CUBO se corta junto con la muestra, con el marco del CUBO y la pared exterior del PDMS actuando como referencia para preservar la orientación de la muestra (Figs. 2d(i) y 4a). A partir de la tinción de inmunofluorescencia del esferoide hiPSC diferenciado con gradiente NE-M, se observó la localización del marcador de neuroectodermo Sox2 y el marcador de mesodermo Brachyury en los respectivos extremos opuestos del esferoide, mientras que en las muestras de control, ambos marcadores se expresaron uniformemente en todo el esferoide (Fig. 4b). Por lo tanto, demostramos un método para preservar la información de orientación del esferoide diferenciado con gradiente de morfógeno al seccionar la muestra tal como está en el CUBO. Sin embargo, una desventaja de este método es que la cuchilla del micrótomo se daña al cortar repetidamente el material acrílico duro y es posible que deba reemplazarse con frecuencia. Este problema puede resolverse utilizando un material más blando para el marco CUBE que sea más fácil de cortar, como policarbonato o teflón. Alternativamente, se pueden usar microtomos de sierra o hojas recubiertas de diamante que se usan comúnmente para cortar muestras duras como el hueso para cortar a través del marco CUBE.

crio seccionamiento e imagen. (i) Pasos para incrustar y seccionar muestras congeladas con CUBE, haciendo uso del marco CUBE como marcador de referencia para la orientación de la muestra. (ii) La inmunotinción del esferoide hiPSC diferenciado con gradiente M-NE mostró un patrón de expresión localizado de marcadores de mesodermo (Brachyury) y neuroectodermo (Sox2), mientras que los controles solo NE y solo M mostraron una distribución uniforme de los marcadores. b Corte e imagen en parafina. (i) Pasos para incrustar y seccionar muestras de parafina con soporte CUBE para evitar la pérdida de muestras, luego retirar la muestra de CUBE y cortar un borde de la muestra para marcar la orientación. (ii) La inmunotinción del esferoide hiPSC diferenciado con gradiente de endodermo (END)-NE mostró un patrón de expresión localizado de marcadores de endodermo (FoxA2) y neuroectodermo (Nestin), mientras que los controles solo NE y END solo mostraron una distribución uniforme de los marcadores.

Para la sección de parafina, se deben tomar algunos pasos adicionales para preservar la integridad y la orientación del gradiente de la muestra en el CUBE (Figs. 2d (ii) y 4b (i) y Fig. 2 complementaria). Si bien la sección con el CUBO se puede realizar con el crioCUBO, que está hecho de una combinación de marco acrílico y pared de PDMS, que es un material blando, es mucho más difícil seccionar el CUBO de parafina, ya que todo el CUBO está hecho de acrílico. lo cual fue una modificación necesaria porque el PDMS no es compatible con los solventes orgánicos usados ​​en el proceso de inclusión en parafina. Durante el proceso de deshidratación inicial previo a la inclusión en parafina, el hidrogel pierde mucho volumen y se contrae en el CUBO. Para evitar el riesgo de perder la muestra que puede desprenderse del CUBE, se diseñó un soporte CUBE que consta de una tapa y una base para cubrir la mayor parte de las superficies abiertas superior e inferior del CUBE pero aún permite que los reactivos entren y salgan del CUBE. la muestra. Luego, el CUBO en el soporte se ató con un alambre para mantenerlos juntos. Después del proceso de parafinización, la muestra se extrajo del CUBE utilizando una plantilla de empuje y se marcó la orientación cortando un borde en una esquina de la muestra. Para demostrar la aplicación del método de la parafina, el esferoide hiPSC se diferenció con medios de diferenciación NE y endodérmico (END) (basado en un protocolo de Lam et al.35) a ambos lados del CUBO. La tinción de inmunofluorescencia de los marcadores de neuroectodermo Nestin y Sox2, y los marcadores de endodermo FoxA2 y Sox17, mostraron localización en los lados NE y END de los esferoides, respectivamente (Fig. 4b (ii) y Fig. 3 complementaria). Por otro lado, las muestras de control sin cultivo en gradiente mostraron una expresión uniforme de los marcadores en todo el esferoide.

Los experimentos de diferenciación FITC/TRITC-dextrano y NE/M, así como END/NE aquí demostraron que los gradientes de morfógeno se pueden generar en el CUBO y se pueden usar para controlar la diferenciación de esferoides celulares. Cabe señalar, sin embargo, que el gradiente generado por la plataforma presentada en este documento se basa únicamente en la difusión libre de moléculas desde la fuente, a través del gel en el CUBE, hasta el sumidero. Dado que la tasa de difusión libre depende del tamaño, la carga y la solubilidad del soluto37, así como del tamaño de poro, la carga y la movilidad del polímero de la matriz de hidrogel38, los estudios experimentales o de simulación detallados tienen en cuenta la generación específica de morfógenos. molécula, la difusividad de cada molécula y cómo las propiedades del hidrogel afectan la difusión de cada molécula39,40,41,42,43,44,45 pueden ser necesarios para comprender los detalles minuciosos del transporte de masa para lograr un control aún más preciso de la generación de gradientes, pero este nivel de precisión está más allá del alcance de este estudio. Alternativamente, asegurar una concentración constante de factores de crecimiento en el medio es una forma de controlar mejor la precisión del gradiente, por ejemplo, con cambios o mezclas más frecuentes del medio, o bombeando un flujo constante de medio fresco a la muestra, aunque estos métodos aumentarían la complicación de los procedimientos de preparación y cultivo.

El papel y los mecanismos de los gradientes de morfógenos en la orientación del destino celular son complejos y aún no se conocen por completo. Cuando las células se autoorganizan para formar patrones específicos del tejido, tanto los gradientes locales generados por las secreciones de las propias células y sus vecinas inmediatas, como los gradientes externos en la MEC que rodea las células generados por células que están más alejadas, como los del mesénquima circundante contribuyen a regular la diferenciación celular15,16. Se han utilizado modelos teóricos como reacción-difusión, información posicional (bandera francesa) o síntesis-difusión-depuración para explicar o predecir las interacciones de corto y largo alcance entre las células y el morfógeno y la formación del patrón resultante29,45, 46, pero estos estudios se centran en el entorno local de las células. Por otro lado, la plataforma de gradiente CUBE tiene como objetivo imitar el suministro de gradientes externos por parte de otras poblaciones de células en la periferia que desempeñan un papel en la formación de estructuras de orden superior de los órganos, como en los patrones de ramificación de la glándula mamaria, riñón , o pulmón47,48,49. Por lo tanto, se requeriría una optimización detallada de la interacción entre las células y los gradientes de varios morfógenos, así como el momento de la formación del gradiente para desarrollar organoides objetivo específicos con el patrón deseado. Además, aunque los factores de crecimiento agregados a ambos extremos de las muestras de control eran exactamente iguales, también existirían gradientes de los factores de crecimiento a medida que ingresaban al gel desde los extremos opuestos, y los estudios a más largo plazo de cómo esto puede afectar el autocontrol -En el futuro sería necesaria la organización de células dentro de esferoides más grandes y más pequeños.

Como el CUBE y el diseño del chip de gradiente se pueden personalizar de acuerdo con las necesidades del usuario, la plataforma también podría ser aplicable para desarrollar organoides altamente complejos, como aplicar gradientes a los cuatro lados del CUBE para generar organoides con ejes anterior-posterior y dorsal-ventral. .

Uno de los principales inconvenientes del uso de PDMS para fabricar el chip de gradiente es la absorción de proteínas y moléculas pequeñas en la superficie del PDMS debido a su naturaleza hidrófoba50,51,52. A pesar de esto, PDMS tiene muchas ventajas, como la biocompatibilidad, la permeabilidad a los gases, la transparencia óptica y el proceso de fabricación fácil. También hay varios métodos relativamente simples que se ha informado que reducen la absorción de proteínas, incluida la mezcla de PDMS con poli(etilenglicol) (PEG) para aumentar la hidrofilia de PDMS53 o el recubrimiento de superficies con teflón, polímero de 2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC) o parafina. cera54,55,56.

Aunque la tinción de inmunofluorescencia de los marcadores de diferenciación muestra una diferenciación localizada del esferoide, la estructura y la morfología de cada muestra varían, como en el caso del control de endodermo en la Fig. 4b (ii). Una posible razón de esta variación es que, aunque se controla el posicionamiento del esferoide celular, el esferoide inicial se forma en una placa de 96 pocillos sin control de la forma del esferoide. Con varios estudios que informan la contribución de las restricciones geométricas en la imitación de patrones y eventos de ruptura de simetría del desarrollo en cultivos in vitro57,58, puede ser mejor aplicar el método de tapa de molde para colocar células individuales en hidrogel 3D antes de la formación de esferoides en el futuro para controle la forma de siembra inicial, por ejemplo, imprimiendo en 3D la forma geométrica deseada con vidrio de carbohidrato y disolviendo el carbohidrato después de que el gel se haya curado para dejar un bolsillo de siembra con la forma deseada correspondiente59.

Una ventaja de la modularidad del CUBE y el diseño del chip es que la elección del material se puede seleccionar de acuerdo con las necesidades de los experimentos. Por ejemplo, si la transparencia óptica es de alta prioridad, un CUBO con una ventana PDMS es más adecuado; mientras que si se requiere la parafinación de la muestra para el análisis posterior al experimento, un CUBO hecho completamente de acrílico sin PDMS es más adecuado, aunque la claridad óptica se reduce ligeramente debido a la incompatibilidad de PDMS con solventes orgánicos. En consecuencia, la elección del material para el gradiente del chip no tiene por qué ser el mismo que el del CUBO, y debe elegirse teniendo en cuenta los pros y los contras del material60,61.

El cultivo de organoides 3D con gradiente de morfógeno ha sido durante mucho tiempo un desafío tanto en términos de configuración complicada del dispositivo de gradiente como en el mantenimiento de la orientación del gradiente durante los procesos de análisis. En este documento, presentamos un flujo de trabajo de cultivo a imagen de gradiente que utiliza el dispositivo de cultivo CUBE modular para configurar fácilmente un dispositivo Gradient-in-CUBE. En comparación con los gradientes generados en chips de microfluidos estándar que se pueden controlar dinámicamente mediante el flujo y la presión, el gradiente generado con nuestro dispositivo de gradiente simple es menos controlable con el tiempo, ya que se basa únicamente en la difusión libre de moléculas. Sin embargo, la plataforma que se presenta aquí se centra en la facilidad de uso para los biólogos y no requiere una configuración complicada que involucre bombas o jeringas. Además, así como la iteración anterior de CUBE se comercializó, la comercialización de CUBE con varias modificaciones para adaptarse a los requisitos de los usuarios aumentaría aún más la facilidad de uso y la adopción de la plataforma CUBE por parte de laboratorios menos inclinados a la ingeniería. Además, después del experimento, la muestra se puede retirar fácilmente del dispositivo sin dañar la muestra mientras se conserva la información sobre la dirección en la que se formó el gradiente. Aunque puede ser necesaria una optimización adicional de los protocolos de cultivo dependiente de los organoides objetivo para determinar las pendientes de gradiente más adecuadas para factores de crecimiento específicos en el material ECM de soporte elegido, las metodologías sencillas y personalizables de este documento tienen el potencial de avanzar significativamente en el desarrollo de organoides a través de la ruptura de la simetría. .

Sin embargo, un punto interesante a considerar en trabajos futuros es la posible contribución de las diferencias en la estimulación mecánica que experimentan las células según el tamaño de los esferoides en relación con el tamaño del bolsillo de siembra creado por la tapa del molde, como el sellado de la bolsillo con hidrogel adicional puede introducir alguna variación en la rigidez del gel debido al exceso de medios en el bolsillo cuando se siembran esferoides en él. La plataforma Gradient-in-Cube en su forma actual solo genera gradientes en una dirección, pero también tiene el potencial de adaptarse para generar gradientes en dos ejes, por ejemplo, los ejes anterior-posterior y dorsal-ventral en el mismo organoide. , que es un trabajo que se está realizando actualmente. Por lo tanto, el flujo de trabajo desde la generación de organoides con diferenciación localizada hasta el análisis con información de gradiente podría proporcionar a los investigadores un método fácil de usar para desarrollar organoides cada vez más complejos para ampliar nuestra comprensión de varios mecanismos, como la ruptura de la simetría, que están involucrados en los procesos de desarrollo.

Las iPSC humanas (IMR90-4; WiCell Research Institute; WB65317) se mantuvieron con mTeSR Plus (STEMCELL Technologies, 100-0276) en placas recubiertas con Matrigel reducido con factor de crecimiento de 9–10 μg/cm2 (Corning, 356231), sometidas a pases de forma rutinaria con ReLeSR (STEMCELL Technologies, 05872), y se cultivaron en una incubadora de CO2 al 5 % a 37 °C. Se analizó la contaminación por micoplasma de las células utilizando el kit MycoAlert (Lonza, LT07-118). Para preparar placas de 96 pocillos para la formación de esferoides, los pocillos se llenaron con 80 μl/pocillo de agarosa al 3 % (Sigma, A9414) y se dejaron solidificar. A continuación, se añadió al pocillo medio StemFit AK02N (Ajinomoto, RC AK02N) más inhibidor de roca 10 μM (Y-27632; Nacalai Tesque, 08945-84) y se incubó. Para la formación de esferoides, se disociaron células con un 70 % de confluencia utilizando ReLeSR y se resuspendieron en medio StemFit +Y27632 después de la centrifugación, antes de sembrar en una placa de pocillos de agarosa. Se usaron células de un plato de 35 mm para hacer 5 esferoides (aproximadamente 2–3 × 104 células por esferoide). Al día siguiente, el medio se cambió a medio mTeSR Plus sin Y27632. Los esferoides se transfirieron al dispositivo CUBE después de un día de cultivo en mTeSR Plus.

La elección del material para el CUBE tuvo que ser cuidadosamente considerada para adaptarse a los requisitos de cada procedimiento, especialmente porque el proceso de parafinación implica el uso de reactivos orgánicos. El marco CUBE se cambió del policarbonato utilizado anteriormente a material acrílico, que es más resistente al tratamiento con xileno durante períodos cortos de tiempo en comparación con el policarbonato. Además, se utilizó polidimetilsiloxano (PDMS), un material biocompatible transparente a base de silicona, como material de la pared lateral para restringir el movimiento de los medios que contienen morfógenos a través del CUBE solo a los lados superior e inferior del CUBE, generando así un gradiente en un solo eje. del CUBO.

Se diseñaron dos tipos de CUBE acrílicos (poli (metacrilato de metilo); PMMA) para este estudio utilizando el software Rhinoceros 3D (Robert McNeel & Associates). Para el corte criogénico, los CUBE se diseñaron con un marco más grueso en la parte superior del cubo para que se pueda unir una junta tórica de nitrilo (AS ONE, 62-3049-63) al cubo (Fig. 2a(i)) para Sellado hermético para reducir la fuga de medios alrededor del cubo durante el cultivo en gradiente. Para hacer las paredes laterales del Cryo CUBE, primero se preparó PDMS (Silpot 184, Dow Toray, 04133124) mezclando la base de elastómero con el reactivo de curado en una proporción de 10:1. Luego, se extendió una capa delgada de la mezcla en una placa de Petri y se desgasificó para eliminar las burbujas de aire. Los marcos de cubo se colocaron en el PDMS, luego se desgasificaron nuevamente y se hornearon a 85 ° C durante 30 min para curar el PDMS. Una vez curado, el PDMS se recortó de los marcos con un bisturí y el proceso se repitió para cubrir los otros tres lados del cubo, dejando abiertas las superficies superior e inferior (Fig. 2a (ii)). El grosor de la pared de PDMS es equivalente al grosor del marco CUBE, que es de 0,75 mm cuando se usaron ~2,8 g de PDMS por plato de 100 mm. Debido a que el PDMS se hincha cuando se expone al xileno, los CUBE para el corte de parafina se diseñaron sin paredes laterales (Fig. 2a (i)). Aunque esto reduce ligeramente la claridad de las muestras, un marco totalmente acrílico aún brinda suficiente visibilidad en campo claro. Para el corte de parafina, los CUBE se diseñaron como un cubo sólido de 5 mm de longitud con un núcleo hueco de 3,5 × 3,5 mm, con un grosor del marco de 0,75 mm (Fig. 2a (i)). Los CUBE para el corte de parafina no tenían paredes laterales de PDMS, ya que el PDMS se hincha en xileno durante el proceso de parafinación. Todos los CUBE se encargaron a empresas de mecanizado (Cryo CUBE de Yumoto Electric Inc, Japón, y Paraffin CUBE de Proto Labs, Japón). Antes de su uso, los CUBE se lavaron dos veces con ultrasonidos, una vez con agua MilliQ y otra con isopropanol (IPA), luego se secaron en el horno durante 2 h.

Para controlar la posición de las células durante la siembra inicial en el CUBO, se diseñó una tapa de molde con una estructura de pilar en la posición de siembra deseada y con ranuras para garantizar que el molde encaje en la parte superior del cubo para que la posición del pilar pueda alinearse. correctamente en el cubo (Fig. 2b(i)). Las tapas de los moldes se imprimieron con una impresora 3D (Agilista 3200, Keyence) y se limpiaron por ultrasonidos dos veces con IPA después de eliminar el exceso de material de soporte de impresión, luego se secaron en un horno a 65 °C. Antes de su uso, la tapa del molde se sumergió en 2-metacrilooiloxtetilfosforilcolina (MPC; Lipidure, NOF Corporation, CM5206E) diluida al 5 % en isopropanol y luego se dejó secar durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). El revestimiento de MPC ayuda a garantizar un desprendimiento más suave del molde del hidrogel. Se adjuntó una junta tórica de nitrilo a la parte gruesa del marco acrílico para el Cryo CUBE, o aproximadamente 1 mm cerca de un extremo del Paraffin CUBE. Los CUBE se colocaron con la junta tórica hacia abajo en un plato y se añadió Matrigel en el CUBE antes de colocar la tapa del molde encima del CUBE y curar el gel en la incubadora durante 25 min. Una vez que el gel se ha curado, se retiró la tapa del molde y se sembraron esferoides de hiPSC en el bolsillo creado por el molde. Luego, se agregó Matrigel adicional a la parte superior del CUBO y se dejó curar durante otros 25 minutos para sellar el bolsillo (Fig. 2b (ii)). Después del curado, el CUBE se transfirió a una placa de 48 pocillos con medio mTeSR Plus y se incubó durante 2 h antes de comenzar el cultivo en gradiente.

Los moldes para hacer la tapa de los chips de gradiente PDMS se diseñaron con ranuras para encajar en la junta tórica y puertos para agregar medios, mientras que la base se diseñó para encajar en el cubo, la junta tórica y dos cámaras de medios separadas (Fig. 2c(i) ). Los moldes PDMS se encargaron a Proto Labs. Para hacer los chips de PDMS, se vertió PDMS sin curar en los moldes, luego se desgasificó y se horneó a 85 °C durante 1 h para curar el PDMS. Una vez curadas, las virutas se desmoldaron, luego se lavaron y esterilizaron de la misma manera que los CUBE. Para ensamblar el chip de gradiente, se colocaron CUBE en la base del chip con la junta tórica colocada en la ranura de la junta tórica y una película adhesiva de doble cara de PDMS (NSD-100, NIPPA) con orificios para acceder a las cámaras de medios cortadas en se usó para sellar la tapa y la base juntas (Fig. 2c (ii)). Después del ensamblaje, las cámaras de medios a cada lado del CUBE se llenaron con los respectivos medios de diferenciación (Fig. 2c (iii)).

El medio de diferenciación de neuroectodermo comprendía una mezcla 1:1 de KnockOut DMEM/F12 (Gibco, 12660-012) y medio Neurobasal (Gibco, 21103-049) complementado con un 10 % de reemplazo de suero KnockOut (Gibco, 10828010), un 1 % de amino no esencial MEM (Nacalai Tesque, 06344-56), 1% GlutaMAX (Gibco, 35050-061), 1 μM LDN1913189 (Sigma, SML0559), 2 μM SB431542 (Nacalai Tesque, 18176-54), 3 μM CHIR99021 (Nacalai Tesque, 187 64 -44), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Nacalai Tesque, 21438-82) y ácido ascórbico 0,5 µM (Nacalai Tesque, 03420-52). El medio basal de mesendodermo comprendía medio RPMI 1640 (Gibco, 11875-093), GlutaMAX al 1 % y penicilina-estreptomicina al 1 % (Gibco, 15140122). Para la diferenciación del mesodermo, se añadió CHIR99021 5 μM al medio basal de mesendodermo los días 0 y 1. Desde los días 2 a 4, se retiró CHIR99021 y se reemplazó con bFGF 100 ng/mL (Nacalai Tesque, 19155-36) y 1 μM all-trans ácido retinoico (Stemgent, 04-0021). Para la diferenciación del endodermo, se añadió CHIR99021 5 μM al medio basal de mesendodermo el día 0, y de los días 2 a 5 se retiró CHIR99021 y se reemplazó con 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, 338-AC-050/CF). El cambio de medios se realizó todos los días descartando los medios usados, lavando una vez con DPBS y reemplazando con medios frescos. Se tomaron imágenes de contraste de fase de los esferoides en el CUBO en el dispositivo de chip usando el microscopio Olympus CKX41 para monitorear los cambios morfológicos en el esferoide.

En el momento adecuado para el análisis, las muestras se retiraron del chip de gradiente y se transfirieron a una placa de 48 pocillos para su fijación. Las muestras se lavaron dos veces con DPBS durante 5 min cada vez, se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 min y luego se lavaron dos veces con DPBS durante 10 min cada vez. Para el seccionamiento criogénico, las muestras se sumergieron en sacarosa al 10 %, 15 % y 20 % (Wako, 194-00011) sucesivamente durante 1 h cada una, y en medio de inclusión de criosección (compuesto Tissue-Tek OCT; Sakura Finetek, 4583) para 10 min antes de incrustar en medio de incrustación y congelar a -80 °C durante 30 min. Después de la congelación, las muestras se retiraron del molde y se seccionaron con un espesor de 30 μm con el CUBE (Fig. 2d(i)) utilizando un micrótomo (Yamato Kohki Industrial, Retoratome REM-710) equipado con una unidad de congelación (Yamato Kohki Industrial , Electrocongelación MC-802A). Las secciones recolectadas en portaobjetos de vidrio se secaron con aire frío durante 30 min, luego en un horno a 40 °C durante otros 30 min, seguido de lavado en agua MilliQ para eliminar el exceso de medio de inclusión. Se eliminó el exceso de agua y las secciones se secaron a TA durante 10 min.

Para el corte en parafina, las muestras se deshidrataron e incluyeron en parafina con el siguiente procedimiento: 70 % de etanol durante 2 h, 70 % de etanol durante la noche, 80 % de etanol durante 1 h, 95 % de etanol durante 1 h, 99 % de etanol durante 1 h, 100 % de isopropanol durante 1 h dos veces, xileno al 100 % durante 1 h tres veces, mezcla 1:1 de xileno y parafina (Nacalai Tesque, 26029-05) durante la noche a 40 °C y parafina durante 1,5 h tres veces a 65 °C. Para evitar la pérdida de muestra debido a la contracción de Matrigel durante el proceso de deshidratación, se diseñó un soporte CUBO con tapa y base unidas por alambre para contener la muestra en el CUBO (Fig. 2d (ii)). Después del paso final de parafina, la muestra se retiró del soporte CUBE y se incrustó en parafina fresca. El CUBO se cortó de la parafina y la muestra se extrajo del CUBO cortando la parafina a lo largo del marco interior del CUBO con un bisturí y presionando el CUBO sobre una plantilla de empuje (Fig. 2d (ii)). Se cortó un borde de la muestra parafinada para marcar la orientación de la dirección del gradiente, y la muestra se seccionó en rodajas de 10 μm de espesor utilizando un micrótomo. La desparafinización se realizó de la siguiente manera: xileno al 100 % durante 10 min dos veces, etanol al 99 % durante 5 min dos veces, etanol al 95 % durante 5 min, etanol al 80 % durante 5 min, etanol al 70 % durante 5 min, agua MilliQ durante 5 min. La recuperación de antígeno inducida por calor se realizó colocando las muestras en tampón de citrato 10 mM (ácido cítrico 1,8 mM, citrato trisódico 8,2 mM, pH 6) y calentando el tampón hasta que hierva, luego enfriándolo durante 1 min. El proceso de ebullición y enfriamiento se repitió 6 veces con 10 s de ebullición seguido de 1 min de enfriamiento. Después del último ciclo, las muestras se enfriaron durante 30 min, luego se lavaron con agua MilliQ durante 5 min, seguido de DPBS durante 5 min tres veces.

Las muestras seccionadas criogénicamente se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % durante 10 min, seguido de tres lavados con glicina 100 mM durante 10 min cada vez. El tampón de inmunofluorescencia (tampón IF) se compuso de Tween20 al 0,5 %, Triton X-100 al 2 % y albúmina de suero bovino al 10 % (BSA; Sigma, 126615) en DPBS. El bloqueo se realizó incubando muestras con tampón IF con suero de cabra al 10 % (Gibco, 16210064) (IF + G) durante 30 min, luego IF + G con IgG anti-ratón de cabra al 1 % (Bethyl Laboratories, A90-116A) durante 20 min. mín. Los anticuerpos se diluyeron (1:200 o 1 μg/mL) de acuerdo con la Tabla complementaria 1. Los anticuerpos primarios se incubaron durante 90 min y los anticuerpos secundarios (Alexa fluor, 1:200, Thermo Fisher Scientific) se incubaron durante 50 min. Después de la incubación de cada anticuerpo, las muestras se lavaron con tampón IF durante 15 min tres veces. Los núcleos se tiñeron con DAPI durante 20 min, luego se lavaron con DPBS durante 5 min tres veces.

Para rastrear la formación del gradiente durante un período de tiempo, se colocó un CUBE lleno con agarosa al 1,5 % en el chip de gradiente con 10 μM de 40 kDa de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (Sigma, FD40S) en DPBS en un extremo del CUBE, e isotiocianato de tetrametil rodamina B (TRITC)-dextrano 10 μM 40 kDa (TdB Labs, TD40) en DPBS en el otro extremo. Cada 24 h, se descartaron tanto FITC-dextrano como TRITC-dextrano, y las cámaras de medios se lavaron una vez con DPBS antes de reemplazarlas con dextrano nuevo. Siguiendo estos pasos, se tomaron imágenes en la ventana del CUBE (ancho = 2,75 mm; alto = 3,5 mm) usando un microscopio de fluorescencia (BZX-700, Keyence) con un aumento de ×4 (campo de visión: ancho = 3,6 mm; alto = 2,7 mm). El área de la ventana del CUBE estaba a 1,5 mm de la fuente en el lado FITC ya 0,75 mm de la fuente en el lado TRITC en x; 0,75 mm de la pared del CUBO en y; y 2,5 mm desde la parte inferior del CUBO en z. Las intensidades de FITC y TRITC se midieron a partir de imágenes de fluorescencia utilizando la herramienta Plot Profile en el software ImageJ sobre un área en el centro de la imagen (w = 2,2 mm; h = 2,2 mm), lo que da la intensidad promedio a lo largo del eje y vertical para cada píxel en el eje x. Luego, la concentración (C) se calculó mediante correlación lineal con una curva estándar de intensidades de dextrano FITC y TRITC de varias concentraciones (Datos complementarios 1). El gradiente se calculó como la relación de la concentración a 0,2 mm y a 2,0 mm (Cx0,2/Cx2,0 para FITC y Cx2,0/Cx0,2 para TRITC) para excluir las regiones de ambos extremos de la ventana CUBE como la proximidad al marco del CUBO afectó la intensidad del dextrano, y para representar la región aproximada del esferoide.

Todos los tamaños de muestra son mayores de cinco y se especifican en las leyendas de las figuras. El valor de p se calculó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (KS) en Matlab.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen subyacentes a la figura 3c y la figura complementaria 1c se proporcionan en los datos complementarios 1.

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Esta investigación fue financiada con fondos de JSPS KAKENHI Grant números 21H01299 y 21K18048. Algunas ilustraciones fueron generadas usando Biorender.

Grupo de investigación pionera, RIKEN, Saitama, 351-0198, Japón

Elizabeth Koh y el rey Hagiwara

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IK y MH concibieron el estudio, diseñaron y realizaron experimentos y analizaron los resultados. IK escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito presentado.

Correspondencia con Masaya Hagiwara.

Los autores poseen las siguientes patentes: (i) Relativas al dispositivo CUBE - Aprobado: 6877009 (Japón), US 11,155,775 B2 (EE. UU.); Pendiente: 201680069487.6 (China); Solicitante: Universidad Metropolitana de Osaka e Instituto de Tecnología de Kyushu; Inventores: Masaya Hagiwara y Tomohiro Kawahara, (ii) En relación con el dispositivo CUBE y el dispositivo fluídico - Aprobado: 7055386 (Japón); Pendiente: 16/484.506 (EE. UU.), 16/484.506 (EP); Solicitante: Universidad Metropolitana de Osaka; Inventor: Masaya Hagiwara, (iii) Relacionado con el corte del dispositivo CUBE - Pendiente: 2022-140997 (Japón); Solicitante: RIKEN; Inventores: Masaya Hagiwara, Isabel Koh. La patente 6877009 tiene licencia para Nippon Medical & Chemical Instruments Co., Ltd.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Marco Fritzsche, Manuel Breuer.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Koh, I., Hagiwara, M. Gradiente para seccionar el flujo de trabajo CUBE para la generación e imagen de organoides con diferenciación localizada. Comun Biol 6, 299 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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Recibido: 27 de septiembre de 2022

Aceptado: 10 de marzo de 2023

Publicado: 21 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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