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Oct 27, 2023

Bioimpresión 3D in situ con biotinta de biohormigón

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3597 (2022) Citar este artículo

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La bioimpresión in situ es atractiva para depositar directamente la biotinta de terapia en los órganos defectuosos para repararlos, especialmente para ocupaciones como soldados, atletas y conductores que pueden lesionarse en una emergencia. Sin embargo, la biotinta tradicional muestra limitaciones obvias en sus complejos entornos operativos. Aquí, diseñamos una biotinta de bioconcreto con microgeles cargados de células electrorociados como solución precursora de metacriloilo (GelMA) de gelatina y agregado como cemento. La capacidad de impresión prometedora está garantizada con un amplio rango de temperatura que se beneficia de las sólidas propiedades reológicas del agregado de microgel fotorreticulado y la fluidez del cemento GelMA. Los componentes compuestos se adaptan simultáneamente a la biocompatibilidad y al microambiente mecánico de diferentes tejidos. La unión fuerte en la interfase tejido-hidrogel se logra mediante enlaces de hidrógeno y fricción cuando el cemento se fotorreticula. Esta biotinta posee buena portabilidad y puede prepararse fácilmente en caso de accidentes urgentes. Mientras tanto, los microgeles se pueden cultivar en mini tejidos y luego mezclarlos como agregados de biotinta, lo que indica que nuestro bioconcreto se puede funcionalizar más rápido que las biotintas normales. Los resultados de la reparación de defectos craneales verifican la superioridad de esta biotinta y su potencial en los entornos clínicos requeridos en el tratamiento in situ.

Como un tratamiento de defecto de órgano emergente, la "bioimpresión in situ"1 propuesta inicialmente por Campbell2. ha estado captando atenciones en la clínica. En resumen, la biotinta terapéutica se deposita directamente en las heridas de los pacientes mediante bioimpresoras quirúrgicas a lo largo de caminos de acuerdo con sus morfologías 3D3. Actualmente, utiliza principalmente métodos similares para la bioimpresión in vitro y se ha aplicado en tratamientos de piel, cartílago y huesos4. En comparación con la implantación de órganos basada en la bioimpresión 3D in vitro, tiene más ventajas por su función de depósito in situ (Nota complementaria 1).

Sin embargo, la bioimpresión in situ es rudimentaria y se ha restringido en aplicaciones clínicas. Además de la falta de bioimpresoras in situ confiables4, una de las razones principales es que hay biotintas menos adecuadas para cumplir con sus requisitos especiales. En estudios relevantes existentes, el bioink aplicado es en su mayoría similar al de la bioimpresión in vitro, es decir, la solución precursora, que no es una opción prometedora para la bioimpresión in situ. (i) En la mayoría de los casos de bioimpresión in situ, no hay condiciones para controlar estrictamente las propiedades reológicas de la biotinta, especialmente la biotinta termosensible. (ii) A diferencia de los sótanos de recepción con superficie limpia y temperatura controlable en las bioimpresoras in vitro, la bioimpresión in situ tiene un sótano de recepción especial, a saber, las heridas del paciente con una temperatura constante (37 °C) y sangre, que puede colapsar el impreso. estructura antes de la reticulación. (iii) La biotinta reticulada debe tener un módulo mecánico bajo para que las células encapsuladas ejerzan funciones terapéuticas. (iv) Las estructuras deben tener altas propiedades mecánicas que coincidan con el defecto, protegiéndose del daño durante la reparación, lo que, sin embargo, conduce a una gran contradicción con el requisito (iii). La construcción de estructuras compuestas, es decir, la impresión de andamios fuertes seguidos de la fundición de hidrogel blando, se ha convertido en una solución eficaz5,6,7,8. Sin embargo, un proceso de impresión tan complejo no se puede realizar en la bioimpresión in situ. (v) Se debe formar una fuerte fuerza de unión en la interfaz de la estructura impresa con defectos. (vi) La biotinta in situ debe ser portátil y fácil de preparar para ocupaciones como soldados, atletas y conductores que pueden resultar heridos en caso de emergencia.

Los microgeles se han convertido en estructuras de bioimpresión populares en la terapia celular9, la liberación controlada de fármacos10, el modelado de enfermedades11, etc., y se han propuesto muchos métodos de fabricación12,13,14,15,16. Recientemente, además de la unidad de función independiente, en la revisión sobre microgeles publicada en Nature Reviews por Burdick et al. 17 en 2020, se ha pronosticado la amplia aplicación de la "bioimpresión secundaria"18,19,20,21 de microgeles como componente de biotinta en el futuro. En el último trabajo de Alge et al. 22 publicado en Science Advances en 2021, se presentó una investigación en profundidad sobre el proceso de disipación de microgeles durante la impresión. Wang et al. 9 microgeles de alginato inyectados para reparar defectos en órganos de ratas. Burdick et al. 23,24 microgeles reunidos extruidos para establecer estructuras 3D específicas. Toda la investigación se benefició no solo de la biocompatibilidad prometedora de los microgeles, sino también de sus propiedades reológicas únicas similares al fluido de Bingham25,26,27, que se muestra como elastómero bajo cierta tensión pero fluye como fluido de Newton una vez que la tensión aumenta aún más. Por lo tanto, la biotinta basada en microgel tiene el potencial de diseñarse aún más como una nueva biotinta de bioimpresión clínica in situ para adaptar los complicados requisitos.

En este trabajo desarrollamos la biotinta de biohormigón (biotinta A–C) para bioimpresión in situ, cuyo nombre proviene de hormigón para la construcción y su abreviatura proviene de los dos componentes principales: árido (A) y cemento (C) ( Fig. 1, Vídeos complementarios 1 y 2). Los microgeles GelMA electrorociados (500 μm) se utilizan como componente principal (A) para obtener propiedades reológicas sólidas similares al fluido de Bingham en entornos complejos (notas complementarias 3 y 4). La solución precursora GelMA (con fotoiniciador) se utiliza como componente auxiliar (C) para garantizar la fluidez y la capacidad de impresión. La estructura compuesta fotorreticulada posee una estructura A/C con módulo mecánico bajo/alto, respectivamente, que resuelve perfectamente la contradicción entre mantener la biocompatibilidad para las células de terapia cargadas y soportar la alta tensión de tracción/compresión alrededor del defecto. Además, el componente C puede infiltrarse fácilmente en la superficie de la herida y formar una alta fricción interna y enlaces de hidrógeno en la interfaz defecto-hidrogel después de la fotorreticulación. Convenientemente, este bioink es portátil porque el componente A/C se puede conservar en nitrógeno líquido, que se puede descongelar con dispositivos de calefacción o con la temperatura corporal en caso de accidente. Mientras tanto, los microgeles se pueden cultivar en mini tejidos antes de mezclarlos, lo que indica que nuestra biotinta de bioconcreto se puede funcionalizar más rápido que las tradicionales. Los resultados del tratamiento in situ de defectos craneales de rata verifican su potencial en entornos clínicos en bioimpresión in situ en el futuro.

Los paneles superiores muestran las propiedades de la biotinta A–C propuesta inspirada en el hormigón para la construcción. Los paneles inferiores (I-VI) muestran el uso de biotinta A–C.

El grado de sustitución (DS) de GelMA se puede modificar fácilmente cambiando las proporciones de gelatina y ácido metacrílico. Una concentración más alta de DS y de solución precursora da como resultado propiedades mecánicas más altas de las estructuras fotorreticuladas28,29. Según nuestra experiencia, el GelMA (EFL-GM-30) de baja DS al 5 % (p/v) tiene propiedades mecánicas bajas y alta biocompatibilidad. Por lo tanto, se seleccionó para electropulverizar microgeles GelMA (A30 / 5, 500 μm), que se ha verificado que posee diámetros muy uniformes (Nota complementaria 4 y Figura complementaria 6). El 20 % (p/v) de GelMA de alta DS (EFL-GM-300) puede soportar la tensión de compresión, como el tejido óseo, mientras que el 20 % (p/v) de GelMA de baja DS (EFL-GM-30) puede soportar el estiramiento estrés, como el tejido del tendón. Así, fueron seleccionados como componente C (C300/20, C30/20). A modo de comparación, también se seleccionó como componente C (C30/5) GelMA de DS bajo al 5 % (p/v) (EFL-GM-30).

Asumimos que el componente C se infiltró exactamente en la vacante entre el componente A para que los microgeles pudieran generar suficiente fricción interna para evitar el colapso antes de la reticulación. El A30/5 acumulado (con GFP) en el tamiz de la celda se empapó repetidamente en C30/5 (con RFP) y se levantó para filtrar el C30/5 redundante (Fig. 2a). C30/5 entró espontáneamente en la vacante entre A30/5 con fuerza capilar. El biotinta A-C reticulado mostró que el componente A estaba estrechamente unido entre sí (Fig. 2b, c). La proporción de volumen del componente A se analizó en áreas rojas / verdes como 73,215 ± 2,312% (Nota complementaria 2), que fue similar a la utilización del espacio atómico en el paquete hexagonal más cercano (HCP) en química cristalina (74,05%) (Fig. 2d) en que el componente A mostró una forma esferoide estándar bajo flotación y tensión superficial en el componente C líquido y el sistema tendió a poseer la energía más baja bajo la gravedad.

un esquema del método de humectación en el experimento de análisis de proporción de volumen. b Morfología óptica de la estructura compuesta A–C. c Morfología fluorescente de la estructura compuesta A–C (Zen, Carl Zeiss, versión 8,0,0,273). d Celosía de paquete armario hexagonal en química de cristales. e Las partes del kit de biotinta A–C. f–k Los pasos de preparación del bioink A–C portátil. Para b, c, cada experimento se repitió de forma independiente con resultados similares 3 veces.

Se diseñó una bolsa de emergencia para cumplir con los requisitos de almacenamiento y portabilidad (Fig. 2e). Las celdas de carga de un componente se sumergieron en un medio de crioconservación y se almacenaron en un tubo de congelación como se describió previamente por Ouyang et al. 30. El componente C también se almacenó en otro tubo de congelación. Las proporciones de volumen del componente A/C en un kit fueron 74,05 %/25,95 %, respectivamente. Ambos tubos de congelación se almacenaron en un recipiente lleno de nitrógeno líquido.

En un accidente, los tubos de congelación se sacaron del contenedor y se descongelaron con una pequeña almohadilla térmica a 37 °C alimentada por una batería USB portátil (Fig. 2f). Para accidentes muy urgentes sin dispositivos de calefacción, se podrían calentar directamente utilizando la temperatura corporal. Ciertamente, se debe notar la lesión por frío en la piel del paciente. Luego, el medio de crioconservación se retiró con una jeringa y una servilleta. Se transfirió un componente al componente C con una cuchara delgada y se agitó uniformemente, seguido de transferencia de biotinta A–C a una nueva jeringa con boquilla de impresión cónica para bioimpresión in situ con bioimpresoras in situ profesionales o solo con las manos, seguido de fotorreticulación con 405 -nm linterna azul, que ha sido verificada como segura y ampliamente utilizada en escenarios clínicos actuales, como fotocurado de dientes, tratamiento con luz azul de la ictericia neonatal, etc.

En la práctica, el volumen total de bioink está determinado por los volúmenes y cantidades de los tubos de congelación aplicados. Al final de la producción de biotinta A–C, la biotinta A–C preparada se puede cargar con diferentes tipos de tubos de congelación según los requisitos de producción. Además, en el extremo del rescate, en términos de la cantidad de tubos de congelación, los rescatistas definitivamente pueden tomar tantos tubos de congelación que carguen biotinta A–C como sea posible de acuerdo con la situación de la lesión del paciente. Por lo tanto, con el mayor desarrollo y la producción en masa de biotinta A-C, este sistema de biotinta sería factible para la bioimpresión in situ de defectos de tejido tan grandes como sea posible.

A–C bioink debe poseer una alta robustez reológica en diferentes condiciones de temperatura para adaptarse a diferentes situaciones de accidentes de tratamiento in situ. Se prepararon A30/5–C30/20, A30/5–C300/20, A30/5–C30/5 y C bioink C30/20, C300/20, C30/5. Se seleccionaron 4, 24 y 37 °C, bajo los cuales la solución precursora de GelMA estaría en gelificación excesiva, sol-gel optimizado y estado de solización excesiva para la extrusión de bioimpresión, respectivamente31,32.

Los resultados del barrido de flujo indicaron que tanto las biotintas A-C como las biotintas C tenían una función de adelgazamiento por cizallamiento bajo las tres temperaturas seleccionadas (Fig. 3c), cumpliendo con el requisito básico de extrusión de bioimpresión. Esto se debió a que los microgeles GelMA se separaron unos de otros y la fricción entre ellos desapareció a una alta velocidad de cizallamiento. Además, la orientación de las moléculas GelMA discretas en el componente C tendía a ser coincidente y se redujo el entrelazamiento de moléculas (Fig. 3a). Según estudios publicados9,33, el sistema compuesto principalmente por microgeles tenía propiedades de fluido Bingham. Los datos de barrido de flujo de biotintas A–C se ajustaron además con el modelo de fluidos de Bingham de la siguiente manera:

en donde \(\sigma\), \({\sigma }_{\rm {{y}}}\), \({\eta }_{{\rm {B}}}\) y \(\ dot{\gamma }\) es la tensión, la tensión de fluencia, la viscosidad de Bingham, la velocidad de corte, respectivamente. Todos los bioenlaces A – C mostraron una característica de fluido de Bingham y una relación lineal entre el estrés y la velocidad de corte por encima de cierto estrés (Fig. 3d, e). El límite elástico aumentó a 4 ° C debido a la gelificación excesiva del componente C durante el cual las moléculas de GelMA formarían una espiroqueta similar al colágeno, un agregado de espiroqueta y una red agregada en sucesión (Fig. 3b). La característica sólido/fluido por debajo/por encima del límite elástico se debió a la fricción interna entre el componente A y la mala posición de los microgeles más allá de la fricción estática, respectivamente.

a El mecanismo de la función de adelgazamiento por cizallamiento de la biotinta A–C. b El mecanismo de transferencia sol-gel de la solución precursora GelMA. c Prueba de barrido de flujo. d Adaptación con modelo fluido de Bingham. e Estrés de fluencia. (n = 3 experimentos independientes. Los datos se presentan como valor medio ± DE.) f Prueba de frecuencia de oscilación. g Prueba de tixotropía. h Prueba de rampa de temperatura de flujo reciclado.

Bioink debe tener fluidez para formar filamentos a partir de las boquillas y mostrar características sólidas para mantener la forma. Los resultados de las pruebas de frecuencia de oscilación mostraron que todos los biotintas AC bajo diferentes temperaturas poseían una característica sólido/fluido bajo baja/alta frecuencia, respectivamente, beneficiándose de la propiedad fluida de Bingham (Fig. 3f). Sorprendentemente, la biotinta GelMA monocomponente tradicional se transferiría a la solización y no podría mantener la forma a la temperatura corporal (37 °C). Sin embargo, incluso por debajo de los 37 °C, la biotinta A–C todavía mostraba estado sólido a baja frecuencia, lo que verificaba su viabilidad para depositarse en heridas. Los resultados de la tixotropía al agregar amplitudes de oscilación variadas periódicamente (200% y 1%) indican que la transferencia de estado de la biotinta AC fue rápida y obvia, lo que confirma su rápida velocidad de autorreparación. (Figura 3g)

Los biotintas termosensibles necesitan tiempo para alcanzar un estado estable bajo cierta temperatura. Además, para una temperatura determinada, el estado sol-gel en un momento determinado se vería afectado por el estado anterior y sería totalmente diferente durante el proceso de aumento/disminución de la temperatura. Se llevaron a cabo pruebas de rampa de temperatura de flujo de biotinta A–C y C para examinar la variación de la viscosidad en temperaturas que aumentan/disminuyen repetidamente (4–39 °C, 5 °C/min) tres veces (I–III) (Fig. 3h ). Los resultados mostraron que incluso las curvas de viscosidad del proceso de aumento/disminución de la temperatura de la misma biotinta no se superponían, lo que verificaba la reversibilidad y la estabilidad del estado deficiente de la biotinta termosensible. Sin embargo, en comparación con la biotinta C, las zonas rodeadas por las curvas de viscosidad en las tres pruebas continuas de la biotinta A-C casi se superpusieron, lo que indica que la biotinta A-C podría evitar efectivamente el efecto del estado anterior. Además, para un rango de cambio de temperatura tan amplio, la viscosidad de la biotinta C se estiró de 4 a 5 magnitudes, mientras que la de la biotinta AC se mantuvo dentro de 1 magnitud debido al papel dominante de los microgeles. Sorprendentemente, las prometedoras temperaturas de bioimpresión de 20 a 24 °C también fueron el rango de cambio de viscosidad dramático. Podría imaginarse que una vez que ocurriera una pequeña temperatura que flotara en este rango durante la bioimpresión in situ, la viscosidad de la biotinta tradicional variaría considerablemente y generaría un riesgo impredecible, mientras que la biotinta A–C puede mantener perfectamente la estabilidad de la viscosidad en gran medida y garantizar la validez del tratamiento.

Se estableció una escena de bioimpresión in situ simulada para evaluar la imprimibilidad de la biotinta AC a partir de los estados de extrusión y deposición. Para el estado de extrusión, se seleccionaron tres temperaturas ambientales (4, 24, 37 °C) y A30/5–C300/20 y C300/20 y se extruyeron a un caudal constante. (Figura 4a). A 37 °C, la biotinta C se encontraba en un estado de solización excesiva y formaba gotitas. A 4 °C, el biotinta C estaba en un estado de gelificación excesivo y se había convertido en hidrogel a granel en la jeringa, formando fragmentos de forma intermitente. La biotinta C mostró una buena capacidad de impresión solo a 24 °C y formó filamentos uniformes. Sin embargo, la biotinta A–C, gracias a su gran robustez reológica, pudo formar filamentos uniformes a las tres temperaturas. Para el estado de deposición, la temperatura ambiente se fijó en 24 °C para lograr el mejor estado de extrusión. Para simular las heridas de los pacientes, la plataforma receptora se fijó a 37 °C (temperatura corporal) y se embadurnó con una solución de colorante alimentario (sangre) (Fig. 4b). La biotinta A-C depositada podía mantener perfectamente la estructura 3D mientras que la biotinta C se derretía y mezclaba gradualmente con la "sangre". Por lo tanto, A–C bioink mostraría una gran adaptación a las complejas condiciones que rodean las heridas. Además, la biotinta AC se imprimió con éxito con una bioimpresora 3D comercial para establecer un cubo 3D con 12 capas y 7,5 mm de altura en la temperatura ambiente aproximadamente controlada (30 °C) y en el sótano receptor de la "herida". (Fig. 4c, Notas complementarias 5, 9 y Video complementario 3).

a Las formas de filamento extruido en diferentes temperaturas. b Mantenimiento de la forma en "herida" llena de "sangre" a 37 °C. c Impresión 3D de un cubo en la "herida" lleno de "sangre" a 37 °C con biotinta A–C. d Mecanismo de formación de la fuerza vinculante estable. e Fricción interna en la interfaz. f Enlaces de hidrógeno entre grupos amino en tejido y grupos aldehído fotogenerados en GelMA. g Prueba de unión a la tracción con biotinta A–C y tendón de cerdo. h Prueba de tensión de unión de A30/5–C30/20 con tendón de cerdo. i Prueba de unión a la compresión con biotinta A–C y costilla de cerdo. j Prueba de tensión de unión de A30/5–C300/20 con costilla de cerdo.

En la bioimpresión in vitro, las estructuras 3D se entrecruzan en la plataforma de deposición, lo que da como resultado la falta de una fuerte fuerza de unión con los tejidos después del trasplante. Durante la terapia, el desplazamiento de las estructuras trasplantadas puede ser inválido o peligroso para los pacientes. Por el contrario, la biotinta AC depositada in situ formaría una fuerte fuerza de unión en la interfaz defecto/hidrogel (Fig. 4d). Esto se debe a que el componente C puede mostrar fluidez después de ponerse en contacto con la temperatura corporal e infiltrarse fácilmente en la vacante del defecto, aumentando los sitios de unión en la interfaz y la fricción interna (Fig. 4e). Además, según las propiedades químicas especiales de GelMA, las estructuras compuestas A-C pueden generar una fuerza de interfaz auxiliar en la herida, lo que probablemente se debió a los grupos aldehído fotogenerados que se unen con los grupos amino en la superficie del tejido34 (Fig. 4f). Para observar claramente la fuerte fuerza de unión, se vertió biotinta A30/5–C30/20 sobre tendón de cerdo fresco (Fig. 4g), mientras que se vertió biotinta A30/5–C300/20 sobre costilla de cerdo fresca (Fig. 4i). Se agregaron fuerzas en todas las direcciones a las estructuras A–C (Video complementario 4). Estructuras A-C fuertemente adheridas a la superficie del tejido. Para explorar la fuerza de unión entre el biotinta A–C y la superficie del tejido, se vertieron A30/5–C30/20 y A30/5–C300/20 (alrededor de 2 mm de altura) y se fotorreticularon entre dos piezas de tendón de cerdo fresco (sección transversal). era de aproximadamente 3 cm × 1 cm) y dos piezas de costillas de cerdo frescas (la sección transversal era de aproximadamente ⌀ 1,6 cm), respectivamente. La tensión de unión se probó mediante el método de estiramiento de la estructura tejido-hidrogel-tejido cortando dos piezas de tejido en la dirección opuesta a 1 mm/min. La tensión de unión entre A30/5–C30/20 y el tendón del cerdo podría superar los 4000 Pa (Fig. 4h) y la tensión entre A30/5–C300/20 y la costilla del cerdo podría alcanzar casi los 6000 Pa (Fig. 4j). Ocurrieron dos pasos en A30/5–C300/20 y la curva de la nervadura porque A30/5–C300/20 era más adecuado para la compresión y formaría grietas durante la prueba de estiramiento. Todos los resultados indicaron que la biotinta A–C cumpliría con el requisito de una fuerte fuerza de unión.

En comparación con el método tradicional para establecer estructuras compuestas, es decir, la impresión de andamios reforzados seguido de la fundición de hidrogel suave, el método basado en biotinta A-C tiene una superioridad evidente. En primer lugar, el diseño de la estructura puede ser más flexible y fortalecer la red de andamios que se formaría espontáneamente alrededor del componente A. Además, debido a que los componentes A/C son GelMA que poseen dobles enlaces carbono-carbono, durante la fotorreticulación, los dobles enlaces carbono-carbono que no reaccionaron en la superficie de los microgeles GelMA en la electropulverización se romperían y conectarían con los rotos en el componente C, formando fuertes enlaces covalentes en la interfaz A/C (Fig. 5a), que está ausente en los métodos tradicionales.

un mecanismo del proceso de formación de enlaces covalentes estables de la estructura compuesta A-C. b Curva de ensayo de tracción. c Estado de tracción de diferentes biotintas. d Curva de prueba de compresión. e Estado de compresión de diferentes biotintas. f Modelos de simulación de estructura compuesta A-C de tracción/compresión y celda unitaria. g Simulación compresiva de estructura compuesta A–C. h Simulación de tracción de una estructura compuesta A–C.

Las propiedades de compresión de A30/5–C300/20, C300/20, A30/5–C30/5, C30/5 y las propiedades de tracción de A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5 , C30/5 fueron probados. El módulo de compresión fue 204,00, 2608,00, 16,26 y 3,73 kPa, respectivamente (Fig. 5b) y el módulo de Young fue 1,81, 11,98, 0,80 y 1,26 kPa, respectivamente (Fig. 5d), lo que indica que el componente C obviamente fortaleció las propiedades mecánicas de la estructura impresa, lo que también fue probado por la observación visual (Fig. 5c-e).

La distribución de tensiones dentro de la estructura compuesta A–C se analizó con simulación de elementos finitos. La estructura se simplificó como un modelo HCP (Fig. 5f). La condición límite de desplazamiento en el modelo de tracción/compresión se estableció en 50%/10%, respectivamente (Fig. 5g, h). En comparación con la estructura C, el alto estrés de Von Mises se distribuyó entre los microgeles en la estructura compuesta A-C, al igual que un andamio fuerte "impreso" en el interior, lo que hizo posible proporcionar una matriz extracelular (ECM) con un entorno mecánico similar en diferentes A-C. tipos de biotintas. Por analogía con el método de investigación de celdas unitarias en química de cristales, creamos de manera innovadora el concepto de "celda unitaria A-C" con el mismo método de incisión que HCP, mostrando una red regular de alta tensión empaquetada con microgeles de baja tensión en el interior tanto en compresión /modelos de tracción.

Las células del estroma de la médula ósea (BMSC, por sus siglas en inglés) que encapsulan A30/5 se sometieron a electropulverización y se cultivaron para su posterior uso como unidades de terapia celular funcional en biotinta A–C. La viabilidad celular en los días 1, 4 y 7 mostró estar por encima del 90 % con el kit LIVE/DEAD (Fig. 6a), lo que indica la biocompatibilidad básica de A30/5 y la morfología de actina F mostró que las BMSC podrían propagarse gradualmente dentro del Microambiente 3D (Fig. 6b). Además, algunas BMSC que encapsulan A30/5 se cultivaron en medio de inducción osteogénica después de un cultivo básico de tres días. El séptimo día de la inducción, A30/5 se tiñó con fosfatasa alcalina (ALP) y mostró que las BMSC inducidas habían entrado en la etapa osteogénica temprana (Fig. 6c). En el día 21 de la inducción, A30/5 se tiñó con Alizarin Red S (ARS) y mostró que las BMSC inducidas habían entrado en la etapa osteogénica tardía y produjeron nódulos de calcio dentro de A30/5 (Fig. 6d), lo que verificó su capacidad de diferenciación osteogénica y efecto potencial de la terapia. Además, A30/5 con BMSC experimentaría una fuerza de corte de la boquilla de impresión durante la impresión in situ, lo que podría causar apoptosis celular. A partir de los resultados de las pruebas de apoptosis con citometría de flujo (Fig. 6e), la apoptosis causada por la extrusión no fue obvia, lo que demuestra que el entorno blando formado por A30/5 podría proteger a las BMSC encapsuladas de la fuerza de corte durante la extrusión y garantizar la función biológica.

a Viabilidad de las BMSC encapsuladas en microgeles GelMA. b Morfología de actina de las BMSC encapsuladas en microgeles GelMA. c Prueba de ALP del componente A cargado de BMSC inducido osteogénicamente. d Prueba ARS del componente A cargado de BMSC inducido osteogénicamente. e Prueba de apoptosis con Anexina V-FITC/PI por citometría de flujo. Para a–d, cada experimento se repitió de forma independiente con resultados similares 3 veces.

Para examinar la acción terapéutica de la biotinta A-C, la biotinta A30/5-C300/20 con o sin BMSC se depositó directamente dentro del defecto craneal de la rata (columna: diámetro 5 mm y altura 1,5 mm) y se fotoentrecruzó (Fig. 7a). En la segunda semana, la microtomografía computarizada reveló nueva formación de hueso en el grupo A-C cargado con BMSC (Fig. 7c). Sin embargo, no se formó hueso nuevo evidente en el grupo en blanco, y el grupo sin carga de BMSC mostró una cantidad muy limitada de regeneración ósea. Probablemente se debió a que los hidrogeles actuaron como un andamio para las células relevantes en la ubicación del defecto original y proporcionaron más espacio para el crecimiento. Además, el grupo A-C cargado con BMSC exhibió una mejor eficacia de regeneración ósea con un BV/TV más alto (Fig. 7b). En la cuarta semana, el hueso cubrió casi por completo el sitio lesionado en el grupo A-C cargado con BMSC, y el grupo sin carga de BMSC también exhibió más crecimiento de tejido óseo nuevo. Los valores de BV/TV aumentaron con el tiempo en todos los grupos y tanto los grupos con carga de BMSC como sin carga de BMSC fueron significativamente más altos que los del grupo en blanco. De acuerdo con el examen radiográfico, el análisis histológico con hematoxilina y eosina (Fig. 7d) y la tinción con tricrómico de Masson (Fig. 7e) a las 2.ª semana revelaron una nueva formación ósea con la mayor área de superficie en la muestra del grupo cargada con BMSC y sin formación ósea marcada. en grupos en blanco y descargados con BMSC. En la cuarta semana, la formación ósea aumentó en todos los grupos. Las observaciones histológicas a mayores aumentos confirmaron que el hueso neoformado con estructura típica en el grupo cargado con BMSC mostró muchas más regiones de formación de hueso maduro nuevo que los otros grupos, lo que indica que la biotinta A-C cargada con BMSC podría promover la formación de hueso endógeno en un momento crítico. modelo de defecto craneal de rata de tamaño mediano.

a Implantación y fotoentrecruzamiento de biotinta A–C en un modelo de defecto craneal de rata. b Valor BV/TV. (n = 5 ratas. Los datos se presentan como valor medio ± SD con GraphPad Prism 8). Se utilizó ANOVA de dos vías de dos lados seguido de la prueba de comparaciones múltiples post hoc de Tukey. Y la prueba estadística se realizó dentro de los grupos de 2 semanas o de 4 semanas, respectivamente, pero no se realizó en los grupos de 2 semanas y 4 semanas. c Examen de microtomografía computarizada. d Análisis histológico con tinción H&E. e Análisis histológico con tinción tricrómica de Masson. Para d, e, cada experimento se repitió de forma independiente con resultados similares 3 veces.

Los casos clínicos reales de defectos de órganos son causados ​​por todo tipo de accidentes, como incendios, accidentes de tránsito y lesiones militares. Por lo tanto, las morfologías y tamaños 3D de los defectos de los órganos son muy diferentes. Para examinar la capacidad de bioimpresión in situ de la biotinta AC en un entorno clínico, se crearon cuatro "pacientes" de rata con defectos craneales con formas aproximadamente rectangulares, cuadradas, trapezoidales y triangulares (1,5 mm de altura) con un trépano dental (Fig. 8a–c). El sistema de brazo robótico se seleccionó como la herramienta de bioimpresión in situ (Fig. 8b). Se colocaron cuatro "pacientes" de rata en la mesa de operaciones. Los modelos 3D de los defectos se reconstruyeron con un software de diseño asistido por computadora y el programa de rutina de impresión se generó con un software de corte y se cargó en el sistema de control del brazo robótico. Las BMSC encapsuladas con biotinta A30/5–C300/20 se depositaron in situ en el defecto craneal de cuatro "pacientes" y se fotorreticularon con luz azul de 405 nm (video complementario 5). Después de 6 semanas de implantación, la microtomografía computarizada reveló que se formó hueso nuevo desde el borde hacia el centro de los defectos en todos los "pacientes" (Fig. 8d, e), lo que verificó la alta factibilidad de A–C bioink en Terapia de bioimpresión in situ.

Morfologías de una estructura 3D de los modelos de defectos craneales de rata. b Pasos de bioimpresión in situ con biotinta A–C. c Morfología original del defecto craneal del "paciente". d Microtomografía computarizada después de 6 semanas de tratamiento in situ. e Valor de BV/TV después de 6 semanas de tratamiento in situ.

La mayoría de los estudios actuales de biotinta a base de microgel solo depositaron microgeles reunidos in vitro/vivo para formar estructuras 3D, que pueden colapsar o ser expulsadas del sitio de la herida hipodérmicamente con las actividades diarias de los pacientes. Mientras tanto, las excelentes características y la revolución de la biotinta basada en microgel se han ignorado en la bioimpresión in situ. La biotinta de bioconcreto propuesta aquí contenía un componente de cemento bajo demanda, es decir, una solución precursora de hidrogel diferente en el sistema de biotinta, y la interacción entre el agregado y el componente de cemento resolvió con éxito los problemas que se han restringido en el desarrollo de ensayos clínicos in situ. bioimpresión. Al combinar las propiedades reológicas prometedoras de los microgeles y la capacidad de ajuste mecánico de GelMA, la biotinta A–C mostró una buena robustez de impresión in situ, simplicidad en el establecimiento de la estructura compuesta, acción terapéutica in vivo, fuerza de unión en la interfaz tejido/hidrogel y portabilidad.

Hasta el momento, se han propuesto más y más métodos de fabricación de microtejidos funcionales. Además, el componente A cargado de células puede preinducirse fácilmente con un medio de inducción específico y almacenarse en nitrógeno líquido para una mejor portabilidad y efecto terapéutico, lo que hace posible realizar la producción y el transporte en masa de biotinta A–C para cumplir con los requisitos clínicos. . Creemos que A–C bioink desempeñará un papel importante en el tratamiento de defectos de órganos y dará un gran impulso al desarrollo de tecnología de bioimpresión clínica in situ.

En el futuro, A–C bioink se puede diseñar de más formas. Para el componente A, las especies de células en el componente A se pueden cambiar para más funciones (Nota complementaria 7). Además, en nuestro estudio anterior35 se fabricaron microgeles jerárquicos, con los que se pudieron realizar acciones de tratamiento sinérgicas. Para el componente C, GelMA es el único biomaterial aplicado aquí y otros biomateriales podrían ser sustitutos como el ácido hialurónico metacriloilo (HAMA) con alta ajustabilidad mecánica36,37,38,39,40. Además, en la exploración, encontramos que el componente A que encapsula las células endoteliales podría vascularizarse mediante el componente C que encapsula las células tumorales que secretan el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) 41,42 (Nota complementaria 8), que probablemente realizaría la vascularización in situ en defectos de órganos. Además, el problema de suministro de nutrición/gas en la estructura de hidrogel a gran escala es un problema común en la bioimpresión in situ o en la bioimpresión in vitro. Afortunadamente, los investigadores de nuestro laboratorio43 o de otros laboratorios44 han propuesto una serie de formas efectivas de resolver este problema. Por lo tanto, en el futuro, la biotinta A-C de próxima generación podría diseñarse con un componente sacrificado o un componente de separación de fases para formar más red de nutrición en la estructura A-C.

Teniendo en cuenta la portabilidad y la viabilidad de múltiples escenas, hacemos un llamado al desarrollo de equipos inteligentes y portátiles para la bioimpresión in situ con biotinta A–C en el futuro. Como suposición, se podría diseñar un dispositivo de calentamiento integrado de botella compuesta, una batería portátil y una linterna. Además, desde el punto de vista del desarrollo urbano, las "estaciones de nitrógeno" como las gasolineras y las "bioimpresoras portátiles in situ compartidas" como las bicicletas compartidas pueden establecerse en puestos públicos como servicio social, de modo que el almacenamiento a largo plazo de biotinta A–C en se pueden garantizar viajes largos y la inmediatez de la bioimpresión in situ.

Se preparó una solución de prepolímero GelMA pura al 5 % (p/v) disolviendo GelMA liofilizado (EFL-GM-30, pureza > 99,9 %) y fenil-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP, 0,5 % (p /v), pureza > 99,8 %) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La solución se filtró a través de un filtro de 0,22 μm. Se formó un campo eléctrico con la boquilla de metal (30 G) y el anillo de metal. El caudal de la tinta de electropulverización se fijó en 50 μl/min y se impulsó mediante una bomba de inyección. El voltaje se fijó en 2,86 kV. La temperatura ambiente se fijó en 30 °C para asegurar la adecuada fluidez de la tinta de electropulverización. Las microgotas electropulverizadas fueron recibidas por una placa de Petri llena de aceite de silicona y reticuladas por luz azul de 405 nm. Los microgeles GelMA reticulados se transfirieron a un tubo centrífugo y se centrifugaron a 128,57 xg durante 5 min (3 veces) para eliminar el aceite de silicona. Los microgeles se almacenaron en PBS. Para los microgeles GelMA cargados con BMSC, se mezclaron BMSC en la tinta de electropulverización a una densidad celular de 5 × 105 células/ml. Los microgeles GelMA cargados con BMSC preparados se cultivaron en medio completo DMEM/F-12 complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (v/v) a 37 °C y CO2 al 5 %.

La solución de prepolímero GelMA puro se preparó disolviendo GelMA liofilizado (EFL-GM-30/EFL-GM-300, pureza > 99,9 %) y fenil-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP, 0,5 % (con v)) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La solución se filtró a través de un filtro de 0,22 μm.

Para la prueba reológica del biotinta A-C, se seleccionó un rotor de placas paralelas de 25 mm y el espacio de prueba se fijó en 2,5 mm (aproximadamente 5 veces el diámetro del componente A). Para las pruebas reológicas de C bioink, se instaló un rotor de placas paralelas de 25 mm y un espacio de prueba de 1 mm en la prueba de 4 °C y un rotor de placas paralelas de 50 mm y un espacio de prueba de 0,5 mm en las de 24 y 37 °C. pruebas C. Para la prueba de barrido de flujo, el rango de velocidad de corte se estableció en 0,1–100 s−1. El ajuste de datos con el modelo de fluidos de Bingham se realizó con MATLAB. Para las pruebas de frecuencia de oscilación, la amplitud se fijó en 1% y el rango de frecuencia se fijó en 1000–0,1 rad/s. Para las pruebas de tixotropía, se añadió a las muestras la amplitud de oscilación periódicamente variada (200 % y 1 %). El período de alternancia se fijó en 30 s, y se examinaron cinco puntos en cada etapa y se repitieron tres veces. Para la prueba de rampa de temperatura de flujo, el bioink experimentó enfriamiento/calentamiento tres veces de ida y vuelta. La tasa de cambio de temperatura se fijó en 5 °C/min.

Para las muestras compresivas, se vertió biotinta A30/5–C300/20, C300/20, A30/5-C30/5 y C30/5 en el molde cilíndrico (φ9 mm × 6,3 mm) y se entrecruzó con azul de 405 nm. luz. Para las muestras de tracción, se vertió biotinta A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5 y C30/5 en el molde cuboide (20 mm × 3 mm × 5 mm). La prueba mecánica se llevó a cabo en una máquina de prueba de muestras de hidrogel. La velocidad de movimiento se fijó en 1 mm/min. La simulación mecánica se ejecutó con COMSOL Multiphysics. Las relaciones de Poisson de las estructuras C30/20 y C30/5 se establecieron en 0,034 y 0,031, respectivamente. La condición límite de desplazamiento en la simulación de tracción se estableció en el 50 % de la longitud original del modelo. Las relaciones de Poisson de las estructuras C300/20 y C30/5 se establecieron en 0,218 y 0,031, respectivamente. La condición límite de desplazamiento en la simulación compresiva se estableció en el 10 % de la longitud original del modelo.

Las BMSC (células primarias de ratas) fueron proporcionadas por el Hospital de Estomatología, la Escuela de Estomatología, la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, el Centro Provincial de Investigación Clínica de Enfermedades Orales de Zhejiang, el Laboratorio Clave de Investigación Biomédica Oral de la Provincia de Zhejiang, el Centro de Cáncer de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310006 Los microgeles GelMA cargados con BMSC electropulverizados se cultivaron en medio completo DMEM/F-12. La viabilidad de BMSC se midió después de 1, 4 y 7 días. La viabilidad celular se probó con el ensayo Live/Dead durante 40 min. A partir de entonces, se aplicó CLSM para generar imágenes de las BMSC encapsuladas mediante la obtención de dos imágenes de cada cuadro: verde para las células vivas y rojo para las células muertas. Los números de células vivas y muertas se analizaron con ImageJ, y la viabilidad de BMSC se calculó como la relación entre el número de células vivas y el número total de células. Para la morfología de las BMSC encapsuladas, se tiñeron con un colorante citoesquelético, incluida la actina, que se tiñó con faloidina TRIC (40734ES75, Yeasen Biotechnology), y el núcleo se tiñó con DAPI. El componente A cargado con BMSC se imaginó con CLSM.

Los microgeles GelMA cargados con BMSC electropulverizados se cultivaron en medio completo DMEM/F-12 durante 3 días. A partir de entonces, se preparó medio de inducción osteogénica DMEM/F-12 con dexametasona (0,1 mM), β-glicerol fosfato sal disódica hidratada (10 mM) y ácido l-ascórbico (50 μg/mL). Los microgeles GelMA cargados con BMSC se indujeron con el medio de inducción preparado. El séptimo día, el componente A cargado de BMSC se fijó con poliformaldehído al 4 % (p/v) durante 30 min y se tiñó con fosfatasa alcalina (ALP). El día 21, el componente A cargado de BMSC se fijó con poliformaldehído al 4 % (p/v) durante 30 min y se tiñó con Alizarin Red S. Las muestras teñidas se observaron con un microscopio óptico.

El A30/5 con BMSC se electropulverizó como se indicó anteriormente, la mitad de los cuales se extruyeron desde una boquilla en forma de cono de 20 G a 150 μL/min. Después de 4 h de cultivo, el A30/5 extruido y no extruido con BMSC se degradó con 20 U/ml de solución de colagenasa II PBS durante 30 min (37 °C) para eliminar el hidrogel GelMA. Las células recolectadas se tiñeron con kits de anexina V-FITC/PI y se analizaron mediante citometría de flujo, respectivamente. Los datos se analizaron con el software FlowJo.

Treinta ratas SD macho de 12 semanas de edad (250-300 g) fueron proporcionadas por el Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Zhejiang (Hangzhou, China). Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética para la Investigación Animal de la Universidad de Zhejiang (número de aprobación de ética: ZJU20210172) y se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Zhejiang. Las ratas SD se asignaron aleatoriamente a grupos, incluidas microesferas de hidrogel en blanco, de hormigón en blanco y de hormigón inducido, para evaluar el potencial osteogénico en un defecto craneal en la implantación de microesferas de hidrogel. Se anestesiaron ratas SD con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2%. Después de un afeitado y desinfección completos, se hizo una incisión longitudinal en el medio del área quirúrgica y luego se separó cuidadosamente el tejido blando para exponer el cráneo. Se eliminó el periostio y se crearon dos defectos bilaterales de 5 mm de diámetro con un trépano dental. A continuación, se implantaron las microesferas de hidrogel en los defectos. Se inyectó penicilina una vez al día después de la operación durante tres días.

Después de 2 y 4 semanas de implantación, las ratas (n = 5 en cada grupo) fueron sacrificadas por asfixia con CO2, y la muestra craneal fue recolectada y fijada en paraformaldehído al 4 % (p/v) para su posterior caracterización. Las estructuras tridimensionales (3D) del tejido óseo regenerado dentro del área del defecto craneal se evaluaron con micro-CT (SkyScan, SkyScan 1176, Bélgica) con los siguientes parámetros de escaneo: una resolución de 18 μm, voltaje de 65 kV, corriente de 385 μA, y filtro A1 de 0,5 mm. La reconstrucción 3D se realizó con el software del sistema (SkyScan, Bélgica). La relación entre el volumen óseo y el volumen tisular (BV/TV) se determinó cuantitativamente con un ROI cilíndrico de 5 mm de diámetro.

Después de 2 y 4 semanas de implantación, los especímenes recolectados se fijaron en paraformaldehído al 4 % (p/v) durante 48 h y se descalcificaron en una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 15 % durante 2 semanas a temperatura ambiente. La solución de EDTA se renueva cada 3 días. Luego, las muestras se deshidrataron a través de una serie graduada de alcohol y se incluyeron en parafina. Se obtuvieron secciones histológicas con un espesor aproximado de 5 μm del centro de las muestras incrustadas, seguidas de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) o tricrómico de Masson para evaluar la formación ósea. Las imágenes se obtuvieron bajo un microscopio de campo claro (Olympus, Tokio, Japón).

Las diferentes morfologías de los defectos craneales se crearon con un trépano dental (5 mm de diámetro, 1,5 de altura). Las morfologías del defecto de los "pacientes" I, II y III eran de forma rectangular, cuadrada y trapezoidal, respectivamente, con 2, 4 y 5 círculos, y la distancia entre centros era de 1 mm. La morfología del defecto del "paciente" IV era de forma triangular con 3 círculos y la distancia entre centros era de 4 mm. Los modelos defectuosos se reconstruyeron en Solidworks y se cortaron con el software Repetier para adquirir la información de la ruta, seguido de la transferencia al programa de control correspondiente que utilizó el software de control del sistema de brazo robótico. El caudal de biotinta se fijó en 150 μL/min y la velocidad de movimiento de la boquilla se fijó en 120 mm/min. La boquilla en forma de cono 20G fue seleccionada como boquilla de impresión. El punto original X-Y de la boquilla se fijó de acuerdo con el borde posterior derecho del defecto craneal, y el punto original Z se fijó de acuerdo con el punto más alto del cráneo alrededor del defecto. La bomba de inyección se fijó en el extremo del sistema de brazo robótico. Después de la impresión con biotinta A-C, la biotinta depositada se entrecruzó con luz azul de 405 nm durante 30 s, y el cuero cabelludo se suturó y esterilizó.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria o de los autores correspondientes a pedido.

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Descargar referencias

Este estudio fue patrocinado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFA0703000, YH), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. U1909218, YH), el Fondo Científico para Grupos de Investigación Creativa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. T2121004, YH).

Estos autores contribuyeron por igual: Mingjun Xie, Yang Shi.

State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Zhejiang, 310027, Hangzhou, China

Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu y Yong He

Laboratorio clave de procesos y equipos de impresión 3D de la provincia de Zhejiang, Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Zhejiang, 310027, Hangzhou, China

Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu y Yong He

Hospital de Estomatología, Escuela de Estomatología, Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge y Zhijian Xie

Centro Provincial de Investigación Clínica de Zhejiang para Enfermedades Orales, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge y Zhijian Xie

Laboratorio clave de investigación biomédica oral de la provincia de Zhejiang, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge y Zhijian Xie

Centro de Cáncer, Universidad de Zhejiang, 310058, Hangzhou, Zhejiang, China

Yong él

Laboratorio clave de procesamiento de materiales y moldes, Universidad de Zhengzhou, 450002, Zhengzhou, China

Yong él

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MX realizó todos los experimentos de fabricación e in vitro y escribió el artículo con aportes de todos los autores. YS realizó los experimentos con animales y la caracterización. CZ y MG asistido para realizar los experimentos con animales y la caracterización. JZ ayudó en el diseño del programa de ruta de bioimpresión in situ y la operación del brazo robótico. JF, ZC y ZX contribuyeron al diseño del estudio. YH organizó el proyecto y dio sugerencias de proyectos.

Correspondencia a Yong He.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Junji Fukuda y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Xie, M., Shi, Y., Zhang, C. et al. Bioimpresión 3D in situ con biotinta de biohormigón. Nat Comun 13, 3597 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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Recibido: 09 noviembre 2021

Aceptado: 20 de mayo de 2022

Publicado: 23 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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