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Jun 03, 2023

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Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3385 (2022) Citar este artículo

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Los grupos de células tumorales circulantes (CTC) extremadamente raros son cada vez más apreciados como precursores altamente metastásicos y prácticamente inexplorados. Las tecnologías están diseñadas principalmente para detectar CTC individuales y, a menudo, no tienen en cuenta la fragilidad de los grupos ni aprovechan los marcadores específicos de grupos para una mayor sensibilidad. Mientras tanto, las pocas tecnologías dirigidas a los clústeres de CTC carecen de escalabilidad. Aquí, presentamos Cluster-Wells, que combina la velocidad y la practicidad de la filtración por membrana con la detección sensible y determinista que ofrecen los chips de microfluidos. Los >100 000 micropocillos de Cluster-Wells detienen físicamente los grupos de CTC en sangre completa sin procesar, aislando suavemente prácticamente todos los grupos a un rendimiento de >25 ml/h, y permiten recuperar grupos viables del dispositivo. Usando Cluster-Wells, aislamos grupos de CTC que van desde 2 a más de 100 células de pacientes con cáncer de próstata y ovario y analizamos un subconjunto usando secuenciación de ARN. El aislamiento de rutina de los grupos de CTC democratizará la investigación sobre su utilidad en el tratamiento del cáncer.

Las células tumorales circulantes únicas (CTC) extraídas del torrente sanguíneo de pacientes con cáncer brindan información valiosa sobre el estadio de la enfermedad1, permiten un pronóstico y diagnóstico mínimamente invasivos2,3,4, mejoran nuestra comprensión de la metástasis a nivel celular5,6 y ofrecen la potencial para mejorar el manejo clínico del cáncer7,8. Además de estos CTC individuales, los agregados de CTC que permanecen adheridos en circulación han sido de gran interés científico y clínico desde la década de 1950. Aunque estos grupos de CTC, o microémbolos tumorales circulantes, son extremadamente raros (estimados en solo 2 a 5% de todos los CTC), son desproporcionadamente eficientes para sembrar metástasis. Se estima que su propensión metastásica es 100 veces mayor que la de las CTC individuales9,10,11, en función de su menor tasa de apoptosis y atributos reducidos de supervivencia prolongada9,12. Además, se encontró que un subconjunto de grupos de CTC derivados de pacientes incluía células inmunitarias del huésped13,14, lo que destaca la utilidad de estos precursores metastásicos para arrojar luz sobre las interacciones tumor-sistema inmunitario y su papel en la metástasis. Por ejemplo, se ha demostrado que los grupos de CTC que transportan neutrófilos tienen un mayor potencial metastásico en pacientes con cáncer de mama avanzado14, donde las CTC asociadas a neutrófilos muestran niveles de expresión más altos de proteína marcadora de proliferación (Ki67) y de genes asociados con la progresión del ciclo celular. Los estudios clínicos han respaldado los resultados de estas investigaciones biológicas, encontrando que la presencia de grupos de CTC se asocia con una supervivencia libre de progresión más corta y una supervivencia general del paciente15. El mayor estudio de los grupos de CTC, entonces, ofrece una gran promesa para mejorar la comprensión y el manejo de la metástasis.

Hasta la fecha, el aislamiento confiable y eficiente de grupos de CTC viables se ha visto limitado porque la sensibilidad y la especificidad de las tecnologías de aislamiento de CTC están calibradas principalmente para la detección de células individuales16,17,18,19. Las técnicas de microfiltración, por ejemplo, se emplean ampliamente como ensayos de CTC debido a su operación rápida y sencilla16,19,20. Sin embargo, los grupos de CTC bajo presión fisiológica pueden reorganizarse como estructuras similares a cadenas de un solo archivo y atravesar constricciones tan pequeñas como 5 μm11, lo que sugiere que los agregados probablemente pueden pasar a través de los poros del filtro, dadas las presiones mucho más altas empleadas en la filtración. Además, las fuerzas de cizallamiento más altas experimentadas durante la microfiltración podrían dañar los grupos de CTC o disociarlos en células individuales21, lo que socavaría el enriquecimiento eficiente. Por otro lado, los sistemas de enriquecimiento basados ​​en anticuerpos, que se han utilizado durante mucho tiempo para el aislamiento de CTC individuales17,22,23, solo pueden detectar una subpoblación seleccionada de grupos de CTC dentro de la población heterogénea de CTC debido a su dependencia de antígenos de membrana específicos13 ,24. Además, la proporción más pequeña de área de superficie a volumen de los grupos de CTC afecta negativamente a las eficiencias de inmunocaptura de las tecnologías basadas en anticuerpos25, lo que las vuelve particularmente ineficientes para el enriquecimiento de grupos de CTC. Más prometedores en este sentido son los chips de microfluidos recientes que se dirigen específicamente a los grupos de CTC, que pueden lograr sensibilidades relativamente más altas. Desafortunadamente, lo hacen a velocidades de procesamiento clínicamente impracticables21,26 o bajo la amenaza de daños en los racimos debido a las altas velocidades de flujo en los canales estrechos27, una preocupación especialmente relevante para los racimos grandes, que según se informó estaban compuestos ocasionalmente por hasta decenas de células tumorales28.

Para abordar estas limitaciones para el aislamiento y el estudio de grupos de CTC, hemos desarrollado Cluster-Wells. Este dispositivo de polímero de alta sensibilidad y alto rendimiento aísla cuidadosamente grupos de CTC, pequeños y grandes, de muestras de sangre completa sin procesar sin necesidad de apuntar a antígenos específicos de tumores. En cambio, Cluster-Wells retiene los grupos de CTC en micropocillos diseñados para reconocer físicamente los agregados celulares y preservar su integridad bajo tasas de flujo subfisiológicas. Además, el acceso sin restricciones a los grupos de CTC purificados en micropocillos permite una mayor investigación a través de imágenes y ensayos funcionales y moleculares.

El Cluster-Wells captura grupos de CTC en micropocillos diseñados para retener agregados celulares mientras son permeables a células individuales en la sangre (Fig. 1a). En el fondo de cada pocillo hay una micromalla con aberturas de 15 μm × 15 μm, un tamaño que permite el paso sin obstáculos de leucocitos, eritrocitos y plaquetas. Por lo tanto, la sangre completa sin procesar fluye fácilmente a través del dispositivo, pero los grupos de CTC, demasiado grandes para comprometerse con una sola abertura, se capturan cuando las células individuales dentro del grupo se alojan en las aberturas de malla vecinas. Una vez dentro de un pozo, los grupos de CTC están limitados en la malla por paredes laterales inclinadas, que restringen la reorientación potencial bajo el flujo y protegen las células de las tensiones transversales dañinas que se encuentran en los filtros de membrana tradicionales.

una ilustración esquemática del principio de funcionamiento de Cluster-Wells. Mientras que las células individuales pasan sin obstáculos, Cluster-Wells captura grupos de CTC debido a su morfología multicelular a partir de muestras de sangre de pacientes con cáncer, independientemente del tipo de cáncer y su carácter molecular. b Una foto de los Cluster-Wells fabricados en forma de membrana de 47 mm de diámetro para usar en portafiltros comerciales. La imagen de primer plano (recuadro) muestra pozos individuales diseñados para capturar grupos de CTC. (Derecha) Micrografía electrónica de barrido de un grupo de LNCaP enriquecido con sangre capturado por uno de los pocillos del dispositivo (ver "Métodos": preparación de muestras e imágenes SEM). Barra de escala, 20 μm. c Ilustración esquemática del proceso de fabricación desarrollado para moldear el dispositivo Cluster-Wells de polímero. Los pasos que se muestran en la figura excluyen el proceso de fabricación del molde de silicona y la construcción del molde de PDMS reutilizable, que se puede encontrar en las Figs complementarias. 2 y 3. Micrografías electrónicas de barrido de la estructura PDMS empleada para el micromoldeo (abajo a la derecha) y el dispositivo terminado fabricado con polímero fotocurable, MD700 (abajo a la izquierda). Barras de escala, 50 μm.

Las líneas de malla están diseñadas para ser delgadas (~2 μm de ancho), por lo que funcionan como una cuña entre las células, forzando a las células del racimo a entrar en diferentes aberturas y deteniendo el racimo en las uniones entre células. Para protegerse contra la disociación de grupos por líneas de malla, la velocidad de flujo celular se fijó en un valor tan bajo como 65 μm/s (Fig. 1 complementaria), ~10 veces más baja que la velocidad de flujo libre fisiológica en los capilares humanos29. Para mantener un manejo cuidadoso de los grupos de CTC y al mismo tiempo lograr tasas de rendimiento clínicamente relevantes, operamos una gran cantidad de pozos de captura de grupos en paralelo. Incluso a la velocidad de flujo especificada, 120 000 micropocillos distribuidos uniformemente sobre una membrana de 47 mm de diámetro proporcionaron una velocidad de procesamiento de 25 ml/h (Fig. 1b).

Diseñamos Cluster-Wells como un dispositivo de polímero desechable para garantizar una fabricación rápida y de bajo costo que haría que la tecnología fuera accesible en una variedad de entornos clínicos y de investigación. El proceso de microfabricación combinó micromecanizado de silicio30, litografía blanda31 y técnicas de micromoldeado32 (consulte "Métodos": microfabricación del molde maestro de silicio y moldeado de Cluster-Wells a partir del maestro de silicio). Primero fabricamos un molde negativo de silicio utilizando un proceso de microfabricación de 3 máscaras que involucraba la deposición de una película delgada con pasos de grabado de iones húmedos y reactivos (Figura 2 complementaria). Luego, el molde de silicona se transfirió a polidimetilsiloxano (PDMS) y se replicó mediante litografía blanda. El molde de PDMS negativo resultante se llenó con un polímero fotocurable (Fluorolink MD700, Solvay) y se entrecruzó en el molde para formar el dispositivo (Fig. 1c). El dispositivo fabricado tenía un grosor de 65 μm y era estructuralmente rígido, lo que permitía un fácil manejo. Este proceso nos permite transferir la geometría intrincada que solo se puede lograr con el micromecanizado de silicio a dispositivos de plástico asequibles y desechables.

Para probar y optimizar el funcionamiento de Cluster-Wells, procesamos muestras preparadas añadiendo grupos formados artificialmente de líneas celulares de cáncer humano en muestras de sangre recolectadas de donantes sanos de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB (ver "Métodos": cultivo y preparación de células y coleccion de muestra). En estos experimentos, los grupos de células tumorales se marcaron antes o después con tintes fluorescentes para una identificación positiva. La sangre completa enriquecida con grupos se condujo a través de un Cluster-Wells colocado en un soporte de filtro comercial, seguido de un lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y tinción inmunofluorescente de las células en el dispositivo. Los grupos capturados se identificaron en micropocillos mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 2a).

a Imágenes de fluorescencia representativas de un grupo LNCaP capturado añadido a sangre total sin procesar. Después del lavado y la fijación con PBS, las células tumorales aisladas se tiñeron con citoqueratina (verde) y DAPI (núcleos, azul). Barras de escala, 20 μm. b Ilustración esquemática de la configuración experimental utilizada para los estudios de caracterización. Las células que entraban y salían de las versiones analíticas de Cluster-Wells se rastrearon visualmente y se contaron para calcular la eficiencia de captura utilizando una interfaz microfluídica de 2 canales (ver "Métodos": medición de la sensibilidad del dispositivo). c Eficiencias de captura de grupos para los grupos de LNCaP enriquecidos a diferentes velocidades de flujo. Los datos se proporcionan según el número de células en grupos (n = 3 experimentos independientes). Los datos se presentan como media ± SD. d Tasas de captura de grupos de dos células para grupos de células cancerosas de próstata (LNCaP), mama (MDA-MB-231 y MCF-7) y ovario (HeyA8) a una velocidad de flujo de 25 ml/h (n = 3 experimentos independientes) . Los datos se presentan como media ± SD. Dado que Cluster-Wells se basa únicamente en los atributos físicos de los grupos, capturó de manera eficiente grupos de diferentes tipos de tumores, independientemente de sus antígenos de superficie. e Eficiencias de captura de clúster LNCaP de dos, tres y cuatro celdas para los dispositivos con diferentes tamaños de apertura (n = 3 experimentos independientes). Los experimentos se realizaron a un caudal de 25 ml/h. Los datos se presentan como media ± SD. f Tasas de retención de glóbulos blancos (WBC) para los dispositivos con diferentes tamaños de apertura después de procesar un tubo (10 ml) de sangre completa sin procesar (n = 3 experimentos independientes). Los glóbulos blancos no adheridos específicamente se tiñeron y contaron. Para el cálculo de la tasa de retención, el recuento de WBC obtenido se dividió por el número total de WBC que pasó por el dispositivo, que se obtuvo de un analizador de conteo sanguíneo completo (CBC). Los datos se presentan como media ± SD. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para determinar la eficiencia de captura de los Cluster-Wells bajo diferentes velocidades de flujo, tomamos imágenes y comparamos las poblaciones de racimos con picos que ingresan y salen del dispositivo. Construimos una interfaz de microfluidos de 2 canales para obtener imágenes de cada grupo procesado bajo un microscopio, lo que nos permitió rastrear simultáneamente las células cancerosas fluorescentes en sangre entera durante su entrada y salida dentro del mismo campo de visión (Fig. 2b) (ver "Métodos" : medida de la sensibilidad del dispositivo). Para estos experimentos, teñimos los núcleos celulares en lugar de las membranas celulares o el citoplasma para proporcionar una mejor distinción visual entre las células y facilitar una enumeración más precisa de las células dentro de los grupos. Además, la velocidad de generación de imágenes se estableció lo suficientemente alta como para (1) asegurar múltiples (>4) disparos de cada grupo, asegurando que ninguno de los grupos se perdiera y (2) capturar múltiples conformaciones diferentes dentro del campo de visión, aumentando la precisión del grupo. estimación del tamaño. Validamos (consulte "Métodos": medición de la sensibilidad del dispositivo) la configuración de caracterización optimizada al operar la interfaz microfluídica de 2 canales en un bucle sin el dispositivo conectado para confirmar que no hubo pérdida de células en el sistema (Tabla complementaria 1) y también asegurándose de que los recuentos de grupos obtenidos con nuestra configuración coincidan con los recuentos directos de los grupos capturados en el dispositivo (Fig. 4 complementaria).

Usando Cluster-Wells, procesamos muestras de sangre completa enriquecidas con grupos de células de cáncer de próstata humano (LNCaP) a velocidades que oscilan entre 25 y 750 ml/h (Fig. 2c). A 25 ml/h, el dispositivo aisló casi todos los grupos y solo perdió ~6,8 % de los dobletes. A 250 ml/h, un rendimiento que permite la detección de un tubo de sangre completa en solo ~2 minutos, las células aún fluyeron a través de los micropocillos a velocidades de flujo fisiológicas y el dispositivo capturó todos los grupos de células tumorales que constan de 6 o más células. , ~98,7 % de grupos de 5 células, ~93,8 % de grupos de 4 células, ~89,3 % de grupos de 3 células y ~75,8 % de dobletes. Solo a velocidades de flujo >500 ml/h, los grupos de células enriquecidas se disociaron en el dispositivo, como lo demuestra el desajuste observado entre las distribuciones de tamaño de las poblaciones de células enriquecidas y procesadas (Figura 5 complementaria).

Para investigar la sensibilidad del dispositivo al procesar grupos de células tumorales de diferentes tipos de cáncer, también procesamos muestras enriquecidas con grupos de líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231 y MCF-7) y ovario (HeyA8). Estas células tumorales tienen diferentes propiedades bioquímicas y biofísicas que las células de cáncer de próstata probadas anteriormente, así como diferencias en las afinidades de célula a célula. Aun así, a 25 ml/h, el Cluster-Wells capturó el 90 % o más de los dobletes, el tipo de grupo más evasivo, para todas las líneas de células tumorales, lo que respalda la aplicabilidad de esta tecnología a los cánceres de diferentes tejidos (Fig. 2d). Para poner en perspectiva la sensibilidad medida del dispositivo: Cluster-Wells captura dobletes con el doble de la sensibilidad reportada de un Cluster-Chip21 de tamaño similar, un dispositivo que ya demostró ser más sensible para capturar grupos que las técnicas optimizadas para CTC individuales , mientras analiza la sangre 10 veces más rápido (Fig. 6 complementaria). De hecho, cuando ambas plataformas analizan muestras con el mismo caudal (50 ml/h), Cluster-Wells captura los agrupamientos más pequeños con una eficiencia de casi un orden de magnitud (~9x) superior según las tasas de captura publicadas21 del Cluster -Chip. Incluso cuando se analiza sangre completa a un rendimiento de 100 ml/h, Cluster-Wells es más sensible que todos los métodos de enriquecimiento de grupos de CTC, y solo pierde ~10,4 % de los dobletes y ~2,7 % de los tripletes.

Con el fin de optimizar la geometría del dispositivo para el aislamiento del grupo CTC, investigamos el efecto del tamaño de apertura de la micromalla en el rendimiento del dispositivo. Además de los Cluster-Wells descritos en este documento, diseñamos una versión con aberturas más pequeñas (13,5 μm) y otra con aberturas más grandes (16,5 μm). Probando nuevamente con sangre completa enriquecida con células de cáncer de próstata humano (LNCaP), encontramos que los tamaños de apertura ajustados presentaban compensaciones entre la sensibilidad y la especificidad de la captura de grupos. Si bien cada dispositivo, probado a 25 ml/h, podía capturar todos los grupos más grandes (más de 4 células), la malla de 16,5 μm resultó en una disminución de ~20 % en la eficiencia de captura de dobletes y una disminución de ~2,5 % en el grupo de 3 células captura (Fig. 2e). Por el contrario, la disminución de la apertura a 13,5 μm aumentó la eficiencia de captura de dobletes ~ 5%, para un total de ~ 98% de captura. Sin embargo, la abertura de malla más pequeña también disminuyó la especificidad, lo que permitió una contaminación de leucocitos un ~60 % mayor en promedio (Fig. 2f). Sin embargo, dado que la mayoría de los leucocitos no quedan atrapados mecánicamente, sino que se adhieren a las superficies de manera no específica en ubicaciones aleatorias, aumentar las aberturas de la malla ofreció ganancias decrecientes en la especificidad: las aberturas de malla más grandes (16,5 μm) redujeron la contaminación de leucocitos en solo ~20 %. Al sopesar los datos recopilados de pureza y eficiencia de captura, identificamos la abertura de malla de 15 μm como la opción de diseño óptima, que produjo una contaminación promedio de ~28,8 glóbulos blancos (WBC)/mm2 (<0,06 %) junto con ~331 plaquetas /mm2 (<0,025 %) del procesamiento de 10 ml de muestra de sangre entera no manipulada en nuestras pruebas.

Debido a que la liberación de grupos de CTC viables es crucial para los ensayos moleculares y funcionales aguas abajo, construimos Cluster-Wells a partir de un polímero de baja energía superficial a base de flúor (Fluorolink MD700, Solvay) para mejorar la recuperación de grupos al minimizar la adhesión celular no específica, un método documentado inconveniente de los dispositivos basados ​​en PDMS21. Para evaluar el rendimiento de liberación de Cluster-Wells, intentamos recuperar grupos de células tumorales viables capturados en el dispositivo (Fig. 3a). Después de procesar muestras de sangre entera enriquecidas con grupos de LNCaP a 25 ml/h, lavamos los Cluster-Wells con PBS y liberamos los grupos en placas de Petri a diferentes velocidades de flujo inverso. Usando microscopía de fluorescencia para identificar tanto los grupos liberados con éxito en la placa de Petri de recolección como los que permanecieron en el dispositivo bajo cada velocidad probada, calculamos las eficiencias de liberación de grupos para determinar la velocidad óptima de flujo inverso. La eficiencia de liberación aumentó con velocidades de flujo inverso más altas, lo que desplazó a más grupos adheridos no específicamente al dispositivo. Llegamos a la conclusión de que con una velocidad de flujo inverso promedio de ~6,5 mm/s dentro de los micropocillos (100 veces la velocidad del flujo de captura) durante ~10 segundos, casi todos (~96 %) de los grupos se pudieron recuperar con éxito (Fig. 3b) . Además, confirmamos que la integridad de los grupos liberados se preservó al comparar directamente los tamaños de las poblaciones de grupos capturados y liberados (Fig. 7 complementaria).

a Representación del proceso de liberación. Los grupos de LNCaP se agregaron a sangre total y se procesaron utilizando Cluster-Wells. Después del lavado con PBS, los grupos capturados se liberaron en una placa de Petri mediante la aplicación de flujo inverso. b Eficiencia de liberación del dispositivo a diferentes velocidades relativas de flujo inverso. Después de la liberación, se tomaron imágenes de la placa de Petri y del dispositivo utilizando un microscopio de fluorescencia, y las células se contaron manualmente para el cálculo de la eficiencia de liberación (n = 3 experimentos independientes). Los datos se presentan como media ± SD. c Porcentaje de viabilidad del control y los grupos liberados en una placa de Petri a una velocidad de flujo inverso de 6,5 mm/s (n = 3 experimentos independientes). La prueba de viabilidad de dos colores se realizó en el control y las células liberadas dentro de las placas de Petri (ver "Métodos": medición de la viabilidad celular), que posteriormente se escanearon con un microscopio de fluorescencia. Se contó el número de células viables y muertas para calcular el porcentaje de células viables. Los datos se presentan como media ± SD. d Una foto de los Cluster-Wells y el capilar de un micromanipulador dentro de un micropocillo individual. A diferencia de los dispositivos de microfluidos, se puede acceder fácilmente a los micropocillos individuales utilizando un micromanipulador. e Imágenes de microscopio de fluorescencia de los Cluster-Wells después de retirarlos del soporte del filtro. Debido a la tensión superficial, la solución de colorante fluorescente previamente introducida permanece dentro de los pocillos y el contenido de los micropocillos individuales se puede recuperar mediante un micromanipulador. Cuando se dejan desatendidos, los micropocillos se secan en ~ 10 min. Barras de escala, 50 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La eficiencia de recuperación medida de Cluster-Wells es más alta que la tasa de recuperación de grupos informada anteriormente de Cluster-Chip21 basado en PDMS. Imitando las condiciones de prueba informadas para el Cluster-Chip en nuestros experimentos, usamos Cluster-Wells para procesar muestras de sangre enriquecidas con grupos MDA-MB-231 e intentamos liberar los agregados capturados. Utilizando la misma velocidad de flujo inverso (6,5 mm/s) y la misma duración que se aplicó anteriormente con el Cluster-Chip, pudimos recuperar grupos de Cluster-Wells con >2x (87 % frente a 37 %) la eficiencia del Cluster-Chip (Fig. 8 complementaria). Incluso cuando se compara con la eficiencia de liberación informada de un Cluster-Chip operado a 4 °C para reducir la adhesión celular no específica al chip de microfluidos, el Cluster-Wells demostró una mayor eficiencia (87 % de recuperación para Cluster Wells frente al 80 % para el Clúster-Chip).

A continuación, mediante un ensayo de células vivas/muertas, investigamos la viabilidad de las células tumorales capturadas y posteriormente liberadas de Cluster-Wells (ver "Métodos": medición de la viabilidad celular) (Fig. 9 complementaria). Para estas mediciones, los grupos de LNCaP capturados a partir de muestras de sangre enriquecidas por Cluster-Wells se liberaron con flujo inverso a 6,5 ​​mm/s. Se encontró que la viabilidad promedio de los grupos liberados (~ 95,8 %) era similar a la de la población de control (~ 96,3 %), lo que demuestra que ni el dispositivo ni el protocolo de liberación produjeron un efecto destacado en la viabilidad celular (Fig. 3c).

Para evaluar si podíamos aprovechar el diseño expuesto de Cluster-Wells para recuperar células, también investigamos si los grupos viables podían capturarse directamente de micropocillos usando un micromanipulador (Fig. 3d). Primero, probamos si los grupos capturados podían retenerse de manera segura en los micropocillos mientras el dispositivo estaba configurado para la micromanipulación. Al comparar la cantidad de grupos de imágenes en el dispositivo expuesto con la cantidad de grupos con picos, encontramos que la mayoría (~95,8 %) de los grupos se retuvieron en el dispositivo expuesto. Luego realizamos una prueba por separado para determinar si el dispositivo con sus micropocillos porosos se secaría prematuramente una vez que se sacara del soporte del filtro y se expusiera, lo que prohibiría la recolección de grupos viables. Llenamos los Cluster-Wells con una solución de tinte fluorescente y descubrimos que la hidrofobicidad del dispositivo combinada con la tensión superficial evitaba que el líquido se filtrara a través de la micromalla por gravedad (Fig. 3e). Además, a medida que el líquido se evaporaba sobre la superficie del dispositivo expuesto, los micropocillos eran los últimos en secarse, lo que proporcionaba un aislamiento natural entre los pocillos para que su contenido pudiera recogerse sin diafonía (Fig. 3e).

Para evaluar la posible aplicación clínica del dispositivo, aplicamos la tecnología Cluster-Wells para aislar grupos de CTC de muestras de sangre de pacientes con cáncer de ovario y próstata. Las muestras de sangre, cuyo volumen oscilaba entre 2,8 y 24 ml, se recogieron de pacientes que dieron su consentimiento de acuerdo con los protocolos aprobados por el IRB en los hospitales de la Universidad de Emory y Northside y se procesaron en Georgia Tech dentro de las 4 h posteriores a la recolección (consulte "Métodos": recolección de muestras y recolección de muestras). Procesando). Después de la fijación de células aisladas con paraformaldehído (PFA) al 4 %, las muestras se inmunoteñeron con marcadores de leucocitos y frente a marcadores de cáncer establecidos para la enfermedad específica; también se aplicó una tinción nuclear (4,6-diamidino-2-fenilindol) para identificar positivamente los grupos de CTC del paciente (ver "Métodos": tinción de inmunofluorescencia de grupos de CTC). A continuación, se tomaron imágenes de los grupos inmunoteñidos y se analizaron escaneando los Cluster-Wells bajo un microscopio de fluorescencia. La especificidad del ensayo también se validó para ambos tipos de cáncer mediante el procesamiento de 10 ml de muestras de sangre de donantes sanos (n = 3 cada una), que se confirmó que no tenían grupos de CTC.

Detectamos grupos de CTC en muestras de sangre de pacientes con cáncer de ovario (Fig. 4a) y de próstata (Fig. 4b). El número de células en estos grupos osciló entre 2 y más de 150 células, y este último se encontró en una muestra de una paciente con cáncer de ovario (Fig. 4a, iii). Además de plantear preguntas sobre la circulación fisiológica de los grupos de CTC, el tamaño sorprendentemente grande del grupo de CTC de cáncer de ovario aislado apunta a un posible inconveniente de los chips de microfluidos, incluso si están diseñados teniendo en cuenta los grupos de CTC: un grupo de CTC de este tamaño tendría probablemente obstruyeron los estrechos canales de microfluidos o se dividieron en pedazos más pequeños si se los fuerza. También se encontró que algunos de los grupos de CTC aislados contenían leucocitos en muestras de cáncer de ovario y de próstata (Fig. 4a, ii yb, iii), una observación consistente con informes anteriores sobre grupos de CTC de cáncer de mama14. Para confirmar la cohesión física entre las células en estos grupos de CTC asociados con leucocitos, dichos grupos se expulsaron deliberadamente de los micropocillos y luego se recuperaron.

a Imágenes de microscopio de fluorescencia de los grupos de CTC aislados de pacientes con cáncer de ovario. Las células capturadas se tiñeron con citoqueratina, vimentina (verde), CD45 (rojo) y DAPI (núcleo, azul). Barras de escala, 20 μm. b Imágenes de los grupos de CTC aislados de pacientes con cáncer de próstata metastásico. Las células capturadas se tiñeron con citoqueratina, vimentina, PSA/KLK3, EpCAM (verde), CD45 (rojo) y DAPI (núcleo, azul). Barras de escala, 20 μm. c Grupos aislados de sangre periférica y muestra de ascitis extraída de la cavidad peritoneal de una paciente con cáncer de ovario en el mismo momento. El grupo de CTC aislado fue morfológicamente diferente en comparación con los esferoides tumorales aislados de la muestra de ascitis del mismo paciente. Los esferoides de la muestra de ascitis se fijaron y tiñeron con citoqueratina, EpCAM (rojo), CD45 (verde) y DAPI (núcleos, azul), y los grupos de CTC aislados de la muestra de sangre se fijaron y tiñeron con citoqueratina, vimentina (verde), CD45 ( rojo) y DAPI (núcleos, azul). Barras de escala, 20 μm. d Porcentaje de pacientes con cáncer de próstata (n = 8) y de ovario (n = 9) que se observa que tienen grupos de CTC en sus muestras de sangre. e Número de grupos de CTC observados por mililitro de muestras de sangre de pacientes con cáncer de próstata y de ovario. f Distribución del número de células observadas en los grupos de CTC de próstata y ovario. Los diagramas de caja muestran los percentiles 25 y 75, la línea muestra la mediana y los bigotes muestran los puntos máximos y mínimos. g Porcentaje de grupos de CTC puros y asociados a glóbulos blancos para cada tipo de enfermedad. h Imágenes de los grupos de CTC aislados de una paciente con cáncer de ovario y sometidos a un ensayo de viabilidad basado en fluorescencia. Las imágenes muestran grupos de CTC que estaban compuestos por (i) células vivas y muertas (amarillas) y (ii) solo células vivas. Barras de escala, 20 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para probar la aplicabilidad de Cluster-Wells en el aislamiento de agregados celulares de fluidos corporales que no sean sangre completa, intentamos aislar esferoides tumorales de una muestra de ascitis recolectada de un paciente con cáncer de ovario (consulte "Métodos": procesamiento de muestras). La concentración de esferoides de células tumorales observada en la muestra de ascitis fue significativamente mayor en comparación con la de los grupos de CTC observados en una muestra de sangre periférica recolectada del mismo paciente en el mismo punto de tiempo (~1500 esferoides/ml frente a 0,167 grupos de CTC/ml). Además, se observó que las células tumorales en esferoides aislados eran morfológicamente más grandes que las de los grupos de CTC que aislamos de la muestra de sangre (Fig. 4c y Fig. 10 complementaria).

Entre la cohorte de pacientes que estudiamos (Tablas complementarias 2 y 3), se detectaron grupos de CTC en 6/8 pacientes con cáncer de próstata y en 8/9 pacientes con cáncer de ovario (Fig. 4d). El número de grupos de CTC detectados varió ampliamente entre los pacientes, con concentraciones que oscilaron entre 0,063 y 0,867 grupos/mL en pacientes con cáncer de próstata y entre 0,167 y 59,2 grupos/mL en pacientes con cáncer de ovario (Fig. 4e). En promedio, los grupos de CTC de cáncer de ovario estaban compuestos por más células tumorales que los grupos de CTC de cáncer de próstata con una mediana de 6 células frente a 3 células en el cáncer de próstata (Fig. 4f). Además, el 26,4% de los grupos de CTC de cáncer de ovario aislados contenían glóbulos blancos, mientras que se encontró que el 16,4% de los grupos de CTC de cáncer de próstata contenían glóbulos blancos (Fig. 4g). En conjunto, la heterogeneidad fenotípica observada en los grupos de CTC aislados por Cluster-Wells atestigua el alto rango dinámico y las condiciones de procesamiento suaves que ofrece la técnica. Además, una mayor concentración (0,43/mL frente a 0,28/mL21) de grupos de cáncer de próstata detectados por Cluster-Wells en comparación con Cluster-Chip, aunque en diferentes cohortes, podría deberse potencialmente a la eficiencia de aislamiento superior de Cluster-Wells , dado el pequeño tamaño de los grupos de CTC de cáncer de próstata.

Es importante destacar que los grupos de CTC fueron notablemente más frecuentes en la cohorte de pacientes con cáncer de ovario, con una concentración promedio de 10,32 grupos/mL. La alta incidencia de grupos de CTC en pacientes con cáncer de ovario, particularmente a la luz de los estudios previos sobre CTC individuales en cáncer de ovario33, sugiere capacidades de intravasación altamente eficientes de las células de cáncer de ovario. Además, al investigar la viabilidad de los grupos de CTC de una de las pacientes con cáncer de ovario (consulte "Métodos": evaluación de la viabilidad de los grupos de CTC aislados de muestras de pacientes), encontramos que los grupos de CTC aislados por Cluster-Wells contenían células tumorales viables ( Fig. 4h), que destacó aún más las ventajas del enriquecimiento rápido pero suave proporcionado por la tecnología. En general, el aislamiento de grupos de CTC viables, por lo tanto, podría ser particularmente útil para el diagnóstico y la vigilancia del cáncer de ovario34.

Para demostrar la viabilidad de usar Cluster-Wells para aislar grupos de CTC viables para ensayos moleculares posteriores, realizamos la secuenciación de ARN en grupos de CTC individuales de dos pacientes con cáncer de próstata (consulte "Métodos": preparación y secuenciación de bibliotecas de ARN y análisis de datos de secuenciación de ARN). Las células no fijadas en los Cluster-Wells primero se inmunoteñeron contra antígenos de membrana específicos de tumores y marcadores de leucocitos, y los grupos de CTC fluorescentes se seleccionaron directamente de los micropocillos para secuenciarlos usando un micromanipulador (Fig. 5a) (ver "Métodos": micromanipulación de grupos de CTC de muestras de pacientes). Como las muestras para estudios moleculares se sometieron a un protocolo de tinción diferente que se centró exclusivamente en los marcadores de superficie (Fig. 5b), no se incluyeron en la enumeración de grupos de CTC en pacientes con cáncer de próstata.

a Micromanipulación de un grupo de CTC aislado de la muestra de sangre de un paciente con cáncer de próstata metastásico (Paciente-1). Después de la filtración de sangre y el lavado con PBS, los grupos de CTC viables aislados se tiñeron en el dispositivo usando anticuerpos conjugados con FITC contra EpCAM y el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), se escanearon con un microscopio de fluorescencia y se micromanipularon directamente desde el dispositivo. Barras de escala, 50 μm. b Imágenes de microscopio de fluorescencia representativas de los grupos de CTC de próstata que se someten a RNA-Seq. Las imágenes se tomaron antes de recuperarlas del dispositivo para el análisis molecular. Barras de escala, 20 μm. c Gráfica de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) de los grupos de pacientes secuenciados, las líneas celulares de cáncer de próstata y los glóbulos blancos. d Gráfica de mapa de calor que ilustra los niveles de expresión de genes seleccionados en grupos de CTC aislados de dos pacientes con cáncer de próstata metastásico, líneas celulares de cáncer de próstata y glóbulos blancos. Lecturas de RPM por millón.

Se secuenciaron un total de 6 grupos de CTC de dos pacientes con cáncer de próstata, así como dos conjuntos de glóbulos blancos y dos grupos de líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y PC-3 cada uno. De los grupos de pacientes, obtuvimos una mediana de 83,15 M de lecturas por muestra, con una mediana de 74 M de lecturas mapeadas de forma única (~88,8 %) y una puntuación media de Phred de 36 para la calidad de secuencia media. Detectamos un total de 16,412 transcripciones únicas y usamos el conjunto completo de transcripciones detectadas para realizar un análisis t-SNE para comparar los grupos de pacientes con los glóbulos blancos de control y las líneas celulares de cáncer de próstata (Fig. 5c) y observamos que diferentes grupos del mismo el paciente o la línea celular tendían a agruparse.

En primer lugar, realizamos un análisis DESeq235 comparando los grupos de pacientes con los leucocitos para identificar transcritos expresados ​​diferencialmente e identificamos un total de 3718 transcritos (p-adj < 0,01). La lista clasificada completa de transcritos detectados se usó para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes36 utilizando WebGestalt37, y observamos numerosos conjuntos de genes altamente significativos enriquecidos en los grupos de pacientes, incluidos los genes objetivo MYC, los genes de punto de control G2M, el objetivo E2F y los genes de respuesta a estrógenos (Figs. 12 y 13) de los conjuntos de genes Hallmark 50 y las colecciones de conjuntos de genes de la vía KEGG. Estos conjuntos de genes son compatibles con células proliferativas impulsadas por hormonas, como las células tumorales malignas38,39,40. Además, los grupos de pacientes se enriquecieron negativamente en conjuntos de genes relacionados con las células inmunitarias, como genes de citotoxicidad de células asesinas naturales, genes de enfermedad de injerto contra huésped, genes de respuesta de interferón gamma y genes de diferenciación Th1/Th2, entre otros, lo que sugiere que el transcriptoma de estos grupos diferían de las células inmunitarias sanas del huésped (Fig. 14 complementaria).

El análisis de las transcripciones correspondientes a un conjunto seleccionado de genes para el cáncer de próstata mostró que todos los grupos de CTC expresaban altos niveles de marcadores epiteliales (Fig. 5d). Entre los marcadores epiteliales, la Molécula de Adhesión de Células Epiteliales (EpCAM), la E-Cadherina (CDH1) y la Citoqueratina (KRT) 8, 18 y 19 se expresaron altamente en todos los grupos de CTC, mientras que los grupos de CTC del Paciente-2 también se expresaron notablemente. expresó KRT5. Entre los marcadores mesenquimales, la vimentina (VIM), una indicación de la inducción de la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT)41, fue expresada por la mayoría de los grupos de CTC en niveles relativamente más bajos pero detectables. Además de los marcadores tumorales establecidos, también se examinaron grupos de pacientes en busca de células madre y marcadores asociados a la proliferación. Entre los marcadores de células madre, CD24 se expresó en todos los grupos de CTC en niveles variables, mientras que se encontró que 5/6 grupos expresaban niveles altos (>50 rpm) de CD44. Se ha informado previamente que las interacciones homofílicas de CD44 y las subsiguientes interacciones de CD44-PAK2 median la agregación de células tumorales42 y mejoran la troncalidad, la supervivencia y la progresión metastásica43,44. De manera similar, todos los grupos de CTC expresaron altos niveles de TIMP1, JUN y FOS, que se sabe que estimulan la proliferación celular, inhiben la apoptosis y regulan la angiogénesis45,46. Además, hemos realizado un análisis de enriquecimiento de sobrerrepresentación para el conjunto de genes "TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP" de la base de datos MSigDB del Broad Institute, que enumera los genes que están regulados al alza en el cáncer de próstata en comparación con el tejido benigno47. Como se observa en el gráfico del mapa de calor, todos los grupos de CTC, así como las líneas celulares de cáncer de próstata, expresaron altos niveles de estos genes en consonancia con el origen de su tumor de próstata. También hemos realizado un análisis similar para el conjunto de genes "CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP" de la base de datos MSigDB, que incluye los genes regulados al alza en tumores de cáncer de próstata metastásico en comparación con el tejido primario48. La regulación positiva de los genes asociados con la metástasis en todos los grupos está de acuerdo con el potencial metastásico mejorado de los grupos de CTC9,10. Entre el conjunto, observamos los niveles de expresión más altos en los genes HSPD1 y HSP90AA1 que son miembros de las proteínas de choque térmico (HSP), que desempeñan funciones importantes en el desarrollo y la invasión del cáncer, la progresión, la metástasis y la resistencia a los medicamentos en varios tipos de cáncer49,50. Además, todos los grupos de CTC expresaron altos niveles de G3BP1, que se ha correlacionado con el grado de malignidad del tumor51 y se observó que es más abundante en el cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC)52, lo que concuerda con el diagnóstico clínico tanto del Paciente-1 como del Paciente-1. Paciente-2 (Tabla complementaria 2).

En este estudio, presentamos una tecnología de aislamiento celular que detecta selectivamente grupos de CTC en muestras de sangre sin procesar de pacientes con cáncer. Al capturar grupos de CTC directamente en micropocillos diseñados grabados en una membrana de polímero, Cluster-Wells ofrece ventajas sobre otros métodos para encontrar estos precursores metastásicos en muestras de sangre. En primer lugar, la enorme cantidad de micropocillos que analizan los constituyentes de la sangre en paralelo hace posible analizar muestras clínicas en minutos, al mismo tiempo que garantiza la integridad de los grupos de CTC al someterlos exclusivamente a velocidades de flujo inferiores a las de la circulación fisiológica. En segundo lugar, el formato de dispositivo planar permite dar forma a las trampas de micropocillos directamente en el plano de contacto con los grupos de CTC, lo que elimina la aleatoriedad en la interacción grupo-trampa y permite capturar incluso dobletes con alta sensibilidad. En tercer lugar, el aislamiento de grupos de CTC en micropocillos en lugar de un filtro de membrana tradicional los protege de tensiones externas durante o después del procesamiento, dejándolos accesibles para ensayos posteriores y eliminando la necesidad de sembrar células en un plato. Finalmente, el ensayo de conglomerados de CTC desarrollado solo requiere un soporte de filtro comercial y ningún hardware especializado adicional que no sea una bomba, lo que lo hace fácilmente integrable en flujos de trabajo clínicos o de investigación básicos.

Usando Cluster-Wells en muestras de sangre clínicas, encontramos grupos de CTC en pacientes con cáncer de próstata y de ovario. En particular, se encontraron grupos de CTC en la sangre periférica de la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario en concentraciones relativamente altas. Este hallazgo es importante porque se cree que la diseminación del cáncer de ovario a los órganos circundantes en la cavidad peritoneal está mediada principalmente por agregados celulares en la ascitis, cuya presencia se asocia con enfermedad recurrente quimiorresistente y mal pronóstico53,54. Si bien se descubrió que los grupos de CTC estaban compuestos por células más pequeñas que los esferoides tumorales en la ascitis, eran tan grandes como >150 células en las muestras analizadas, dos observaciones aparentemente contradictorias entre sí y que tienen implicaciones potenciales para la circulación de grupos de CTC en el cuerpo. La frecuencia de grupos de CTC en la sangre periférica de pacientes con cáncer de ovario puede presentar oportunidades valiosas para estudios adicionales a fin de comprender mejor la diseminación hematógena del cáncer de ovario55, así como oportunidades para la detección temprana de la aparición de la enfermedad y la recurrencia del tumor, dos áreas problemáticas importantes para el cáncer de ovario, ya que la enfermedad es asintomática al inicio de su progresión/recurrencia56.

La secuenciación de ARN de grupos de CTC individuales recolectados de micropocillos hizo posible investigar no solo la heterogeneidad tumoral entre pacientes, sino también la heterogeneidad intrapaciente de los grupos de CTC y reveló características normalmente ocultas en el análisis a nivel de tejido. Se encontró que todos los grupos de cáncer de próstata aislados expresaban fuertemente marcadores epiteliales en niveles variables, mientras que tenían una baja expresión de marcadores mesenquimales. Se encontró que cada grupo de pacientes expresaba consistentemente la mayoría de los genes que se informó que estaban regulados al alza en el cáncer de próstata, de acuerdo con su identidad como origen del tumor de próstata. Además, la regulación positiva de los marcadores asociados con las células madre y los altos niveles de expresión de los genes asociados con la invasividad de las células tumorales de próstata en todos los grupos de CTC aislados coincidieron con los informes anteriores sobre el éxito metastásico significativamente mayor de estos agregados celulares. Además de esos rasgos comunes, el análisis comparativo de transcriptomas de grupos de CTC individuales también reveló distintos perfiles específicos de pacientes. Los grupos aislados del primer paciente expresaron AR, KLK3 (PSA) o FOLH1 (PSMA), mostrando un perfil similar a las células LNCaP sensibles a los andrógenos secuenciadas como uno de los controles positivos para las células de cáncer de próstata. Por el contrario, en todos los grupos aislados del segundo paciente, se encontró que esos genes específicos de la próstata estaban regulados negativamente al igual que en las células PC-3 independientes de andrógenos, que se incluyeron como el otro tipo de células de cáncer de próstata de control positivo en nuestro estudio. .

Cluster-Wells permite la detección rápida y el aislamiento de alta sensibilidad de grupos de CTC intactos a partir de muestras de sangre completa sin procesar sin depender de etiquetas específicas del tumor, lo que maximiza el aislamiento eficiente de células cancerosas heterogéneas. Usando lotes de trampas de agrupamiento diseñadas con precisión establecidas en un filtro de membrana de polímero, Cluster-Wells captura y conserva incluso los agrupamientos de CTC más frágiles para una mayor investigación. Debido a que Cluster-Wells se puede integrar fácilmente a los flujos de trabajo clínicos o de investigación sin preparación de muestras, capacitación técnica complicada o instrumentación especializada que no sea una bomba, es una herramienta que puede ayudar a democratizar las investigaciones sobre el papel de los grupos de CTC en la metástasis del cáncer y establecer también su utilidad clínica como marcadores pronósticos para el manejo de la enfermedad.

Se recolectaron muestras de sangre de donantes sanos que dieron su consentimiento en el Instituto de Tecnología de Georgia. El estudio incluyó a 7 participantes sanos (5 hombres, 2 mujeres, rango de edad de 24 a 37 años). Las muestras de sangre de pacientes con cáncer de próstata se recolectaron en el Emory University Hospital y el Grady Memorial Hospital, y las muestras de sangre y ascitis de pacientes con cáncer de ovario se recolectaron en el Northside Hospital. El estudio incluyó a 10 pacientes con cáncer de próstata (hombres, rango de edad de 59 a 71 años) y 10 pacientes con cáncer de ovario (mujeres, rango de edad de 27 a 78 años). Todas las colecciones se realizaron bajo protocolos aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital Northside, la Universidad de Emory y el Instituto de Tecnología de Georgia. Los participantes no fueron compensados ​​por su inscripción.

El molde maestro, es decir, el patrón negativo de Cluster-Wells, se fabricó a partir de una oblea de silicio (100) de 500 μm de espesor y 4 pulgadas de diámetro mediante un proceso de tres máscaras (Fig. 2 complementaria). La fotoprotección SC1813 (Shipley, Marlborough, MA) se utilizó como primera máscara. Siguiendo el giro y el patrón de la fotoprotección, la oblea de Si se grabó a una profundidad de 8 μm usando grabado profundo de iones reactivos (DRIE) para formar los pilares cuadrados. Luego, se depositó una capa delgada (300 nm) de nitruro de bajo estrés en un horno LPCVD. Para modelar el nitruro depositado, la oblea se recubrió con fotoprotector positivo SPR 220-7.0 (Shipley, Marlborough, MA) y se expuso mediante un alineador sin máscara (Heidelberg MLA150). La capa de nitruro debajo de la región expuesta se grabó con grabado de iones reactivos para formar una máscara dura para el proceso de grabado húmedo. El silicio se grabó anisotrópicamente en una solución de KOH al 45 % a 80 °C durante 15 min para formar las paredes inclinadas. Finalmente, para formar el patrón negativo de micropocillos, se usó fotoprotector SPR 220-7.0 como máscara para grabar zanjas cuadradas de 50 μm de profundidad en la oblea usando DRIE. Después de la limpieza tipo piraña (mezcla 3:1 de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) con peróxido de hidrógeno (H2O2)) a 120 °C durante 10 min, la oblea de silicio micromecanizada se recubrió con tricloro(octil)silano en condiciones de vacío durante 8 h antes. a la fundición de PDMS.

Después del micromecanizado de un molde maestro de silicio (consulte Métodos: moldeo de Cluster-Wells del maestro de silicio, figura complementaria 2), se realizó la preparación del molde de polidimetilsiloxano (PDMS) y el patrón del dispositivo de polímero en un entorno de laboratorio. En primer lugar, se mezclaron el prepolímero de PDMS y su reticulante (Sylgard 184, Dow Corning, Auburn, MI) en una proporción de 10:1 y se vertieron sobre el molde maestro de silicona. Después de desgasificar en un desecador durante una hora, el PDMS se curó en un horno a 65 ° C durante 4 h, luego se cortó y se despegó del molde maestro de silicona (Figura complementaria 3a, i). La superficie de la capa de PDMS se activó con plasma de oxígeno y se recubrió con tricloro(octil)silano durante 8 h. La capa de PDMS previamente fabricada y recubierta de silano se usó como molde para la fabricación del molde de PDMS secundario, que tiene el patrón negativo del dispositivo (Figura complementaria 3a, ii). Después del despegue (Fig. 3a, iii complementaria), se usó un molde PDMS secundario para modelar el polímero basado en perfluoropoliéter fotocurable (PFPE) (Fluorolink MD700, Solvay), que se usa como material del dispositivo. Después del proceso de moldeo de PDMS a PDMS, el molde de PDMS secundario (Figura complementaria 3b, i) se colocó en una lámina de tereftalato de polietileno (PET) y se llenó con Fluorolink MD700 mezclado con 4 % p/p de 2-hidroxi-2- metilpropiofenona (Darocur 1173) bajo vacío de 50 mbar. Una vez que se llena el molde, el polímero se cura con luz ultravioleta (Fig. 3a, iv), el molde de PDMS secundario se despegó de la pila de láminas/dispositivos de PET (Fig. 3a, v complementaria) y el dispositivo (Fig. 3a complementaria, v) .3b, ii-iv) se liberó de la lámina de PET subyacente en un enfriador termoeléctrico a 4 °C, lo que promueve una liberación más fácil del dispositivo de polímero sin ningún daño (Fig. 3a, vi complementaria).

Para la caracterización de los Cluster-Wells, utilizamos versiones analíticas de los dispositivos que tienen un área de filtración efectiva más pequeña. Mientras se utilizaba un rango de velocidades de flujo de 1 a 1,5 ml/h debido a la limitación de la velocidad de fotogramas de grabación de la cámara, las velocidades de flujo en las micromallas se organizaron variando el tamaño de los dispositivos, donde la disminución del tamaño correspondía al aumento de la velocidad de flujo. En estos estudios de caracterización, el volumen de la muestra de sangre también se ajustó, dentro de los límites prácticos, para garantizar que la cantidad de células sanguíneas procesadas por cada micropocillo fuera similar a la del dispositivo real (con 47 mm de diámetro) al procesar 10 ml de sangre total. para cada condición probada. En consecuencia, usamos ~750, ~375 y ~200 μL de sangre completa para probar el rendimiento del dispositivo para caudales de 25, 100 y >250 mL/h, respectivamente. Los dispositivos de menor diámetro se montaron en un soporte de filtro de 13 mm de diámetro disponible en el mercado (GE Healthcare Life Sciences) con capas huecas de PDMS del mismo tamaño, que limitan el flujo de fluido a la región de interés con un cierto diámetro y evitan la formación de una región de flujo estancada dentro del portafiltro. Antes de introducir la muestra, la configuración experimental (Fig. 2b) se cebó con etanol puro, seguido de un lavado con PBS. Luego, la configuración se incubó con albúmina de suero bovino (BSA) al 3% durante 1 h para minimizar la adhesión celular no específica. Las células teñidas con colorante Hoechst (consulte la sección separada sobre cultivo celular y preparación) se agregaron a sangre completa y se ejecutaron en la configuración experimental utilizando una bomba de jeringa (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) en el modo de extracción. La sangre con grupos de células enriquecidas atravesó el canal de entrada (50 μm de altura, 500 μm de ancho) de la interfaz microfluídica de 2 canales, el dispositivo/ensamblaje del soporte del filtro y, por último, el canal de salida (50 μm de altura, 500 μm de ancho) de la interfaz microfluídica. Los canales microfluídicos de entrada y salida se grabaron simultáneamente en video a 50 cuadros por segundo en un canal fluorescente (DAPI) utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY) para rastrear las células que ingresan y salen de la versión analítica del Cluster- pozos, respectivamente. Luego, el video grabado fue procesado por un software hecho a la medida (Visual Studio, 2017), y se obtuvo el conteo de grupos que ingresan y salen del dispositivo con respecto al número de celdas dentro de cada grupo, que se utiliza para el cálculo de la captura la eficiencia.

Para probar la confiabilidad del sistema de imágenes, operamos la interfaz de microfluidos de 2 canales en un bucle sin el dispositivo conectado, donde la salida del canal de entrada se conectó a la entrada del canal de salida usando un tubo de 0,02" ID de 8 cm de largo. El experimento se realizó con una bomba de jeringa configurada a 1,5 ml/h y ambos canales de microfluidos se grabaron en video a 50 cuadros por segundo usando el canal de fluorescencia (DAPI). Se usó un software personalizado para extraer los cuadros que tenían eventos celulares en cualquiera de los canales de microfluidos. canales Después de analizar los marcos, observamos que prácticamente no hubo pérdida en el sistema cuando se comparó la distribución del tamaño de los grupos que pasan a través de los canales de entrada y salida (Tabla complementaria 1). , realizamos experimentos de eficiencia de captura a 25 ml/h contando directamente los grupos aislados en el dispositivo. En estos experimentos, se tomaron imágenes de la población enriquecida utilizando un canal de microfluidos como se describió anteriormente para tener recuentos exactos de grupos enriquecidos. Los grupos se inyectaron en un tubo con EDTA que contenía 10 ml de sangre total y la muestra de sangre enriquecida se procesó posteriormente a 25 ml/h utilizando Cluster-Wells. Se tomaron imágenes del dispositivo con un microscopio de fluorescencia y los recuentos de grupos capturados se compararon con la población enriquecida para medir la eficiencia de captura (Fig. 4 complementaria), que coincidía con los datos de eficiencia de captura obtenidos mediante la interfaz microfluídica.

Como muestras biológicas modelo, utilizamos HeyA8 (obtenido del Dr. John F. McDonald, Instituto de Tecnología de Georgia), LNCaP (ATCC-CRL-1740; Manassas, VA), MDA-MB-231 (ATCC-HTB-26; Manassas , VA) y líneas celulares MCF-7 (ATCC-HTB-22; Manassas, VA). Las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 (LNCaP y HeyA8) o DMEM (MDA-MB-231 y MCF-7) que contenía suero fetal bovino (FBS) al 10% (Seradigm, Radnor, PA) en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C. Una vez que alcanzaron el 80 % de confluencia, las células se separaron del matraz de cultivo usando tripsina al 0,25 % (Gibco) durante 2 min. Posteriormente, las células se sedimentaron, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en una solución de PBS 1x mediante pipeteo suave. Para todas las líneas celulares utilizadas en este estudio, inicialmente se encontró que las células sedimentadas se adherían entre sí en grupos de cientos a miles de células y posteriormente se disociaron en grupos más pequeños dentro del rango de tamaño de interés para nuestro estudio mecánicamente mediante pipeteo.

Para los experimentos de eficiencia de captura, se realizó una tinción nuclear para el seguimiento visual de los grupos. Antes de separar las células de la superficie del matraz, los núcleos de las células se marcaron incubando las células en una solución de colorante Hoechst 33342 (Thermo Fisher - Cat No: H3570) de 4 ml (1:1000) durante 20 min en una atmósfera de CO2 al 5 % a 37 °C. C. Después de lavar la solución de tinción, las células se separaron y se resuspendieron en una solución de PBS 1X. Se usaron alícuotas pequeñas (<10 μL) de la suspensión para preparar las muestras de prueba que contenían unos pocos cientos (184–552 grupos) de grupos de células por experimento. La cantidad de grupos con picos en nuestros experimentos se estableció para garantizar que (1) la población de grupos con picos fuera lo suficientemente grande como para contener grupos de diferentes tamaños para una prueba integral y (2) la cantidad de grupos no saturara el dispositivo con la mayoría de los pozos que quedan vacíos.

Para determinar la viabilidad de las células, se realizó un ensayo vivo/muerto (ab115347, Abcam, Cambridge, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo se mezcló a una concentración de 5x (1:200) con la solución de PBS de 1x que contenía el control y las células liberadas. Después de la incubación en un ambiente oscuro durante 15 min, se tomaron imágenes de las muestras con un microscopio de fluorescencia invertido (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY), donde se observaron las células vivas y muertas en los canales verde (FITC) y rojo (TexasRed). respectivamente (Fig. 9 complementaria).

Los racimos capturados se fijaron primero en glutaraldehído al 2,5 % y luego en tetróxido de osmio al 1 %, ambos diluidos en cacodilato de sodio 0,1 M. Después de la fijación, las células se deshidrataron en soluciones de etanol al 50%, 70%, 80% y 95% en agua y etanol al 100% sucesivamente durante 15 min en cada una. La muestra se lavó con hexametildisilazano (HMDS) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) y se secó a temperatura ambiente durante la noche. El dispositivo y los grupos capturados se recubrieron con Pt/Pd usando un sistema de pulverización catódica y se tomaron imágenes usando un microscopio electrónico de barrido Hitachi SU8230.

Se recolectaron muestras de sangre de donantes sanos que dieron su consentimiento en el Instituto de Tecnología de Georgia bajo un protocolo aprobado por el IRB. Las muestras de sangre de pacientes con cáncer de próstata se recolectaron en el Emory University Hospital y el Grady Memorial Hospital, y las muestras de sangre y ascitis de pacientes con cáncer de ovario se recolectaron en el Northside Hospital según los protocolos aprobados por el IRB. Las muestras de sangre se recolectaron en tubos EDTA (BD Vacutainer) y se procesaron dentro de las 4 h posteriores a la extracción de sangre. Para evitar la sedimentación, los tubos se colocaron en un balancín hasta su uso. Las muestras de ascitis de pacientes con cáncer de ovario se transfirieron al Instituto de Tecnología de Georgia en recipientes de vidrio al vacío y se procesaron dentro de las 4 h posteriores a la extracción.

Los dispositivos se colocaron dentro de los portafiltros y se humedecieron con etanol puro. Después de la humectación, se lavó el etanol con 1x PBS. Antes de su uso, el conjunto de portafiltros/dispositivo se incubó con BSA al 3 % durante 1 h para minimizar la adhesión celular no específica en las superficies. Luego, el BSA se eliminó con PBS 1x antes de la introducción de muestras de sangre o ascitis. Tanto las muestras de ascitis como las de sangre total sin procesar se analizaron en los dispositivos utilizando una bomba de jeringa (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) en modo de extracción a un caudal de 25 ml/h. Luego, los dispositivos se lavaron con una solución de PBS 1x durante 1 h antes de la tinción de inmunofluorescencia (consulte la sección separada sobre tinción de inmunofluorescencia de grupos de CTC).

Después de procesar las muestras, las células capturadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) durante 10 min y, posteriormente, se permeabilizaron con Triton-X al 1 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en PBS para 10 minutos. Antes de la tinción de inmunofluorescencia, el dispositivo/portafiltros se incubó con un tampón de bloqueo que contenía suero de cabra al 2 % y BSA al 3 % durante 30 min. Para muestras de próstata, Cytokeratin 8/18 (Invitrogen - Cat No: MA5-32118, Clon: SU0338, (1:400)), Vimentin (Invitrogen - Cat No: MA5-14564, Clon: SP20, (1:1000)) , PSA/KLK3 (Tecnología de señalización celular - Número de catálogo: 5365S, Clon: D6B1, (1:750)), EpCAM (Invitrogen - Número de catálogo: MA5-29246, Clon: 28, (1:400)) y Anti-CD45 (BD Biosciences - Cat No: 555480, Clon: HI30, (1:500)), y para muestras de ovario, Cytokeratin 7 (Invitrogen - Cat No: MA5-32173, Clon: ST50-05, (1:400)), Cytokeratin 8/18 (Invitrogen - Cat No: MA5-32118, Clon: SU0338, (1:400)), Vimentin (Invitrogen - Cat No: MA5-14564, Clon: SP20, (1:1000)) y Anti-CD45 (BD Biosciences - Cat No: 555480, Clon: HI30, (1:500)) se introdujo el cóctel de anticuerpos primarios y se incubó durante la noche. El exceso de anticuerpos se lavó con 1x PBS. Luego, los anticuerpos secundarios correspondientes Alexa Fluor 488 (Invitrogen - Cat No: A-11008, (1:500)) y Alexa Fluor 594 (Invitrogen - Cat No: A21125, (1:500)) se pasaron por el dispositivo, se incubaron durante 1 h y se lavó con PBS 1x. Los núcleos de las células se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen - Cat No: D1306, (1:1000)) durante 10 min y los dispositivos se lavaron con 1x PBS. Por último, los dispositivos se retiraron de los portafiltros y se montaron entre dos portaobjetos de vidrio para obtener imágenes.

Los grupos de CTC vivos capturados se tiñeron con anticuerpos conjugados con Alexa 488 contra EpCAM (tecnología de señalización celular, n.° de catálogo: 5198S, (1:400)), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) (Biolegend, n.° de catálogo: 342506, clon : LNI-17, (1:80)), y los WBC contaminantes se tiñeron con PE-CD45 (TRITC) (BioLegend – Cat No: 368510, Clon: 2D1, (1:40)). El dispositivo con grupos capturados se montó en una placa de Petri y luego se tomaron imágenes usando un microscopio de fluorescencia invertido (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY). Los grupos identificados se micromanipularon directamente desde el dispositivo y se transfirieron a los tubos de PCR que contenían tampón RLT (Qiagen) + BME (Sigma-Aldrich) utilizando el micromanipulador Eppendorf TransferMan 4r. Durante la micromanipulación, la placa se complementó con PBS 1x para evitar que los micropocillos se secaran, lo que se observó que tomaba ~10 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se agitaron en vórtex durante 1 minuto y se transfirieron a un congelador de -80 °C. Se observó que la mayoría de los glóbulos blancos contaminantes permanecían adheridos al dispositivo durante la recuperación de grupos. No obstante, los grupos de CTC micromanipulados de Cluster-Wells se descargaron en una placa de Petri vacía y luego se volvieron a seleccionar para garantizar que no se produjeran posibles artefactos por contaminación de glóbulos blancos en la secuenciación de ARN.

La muestra de sangre se procesó con Cluster-Wells a un caudal de 25 ml/h. Los núcleos de las células capturadas se tiñeron con colorante Hoechst (Thermo Fisher – Cat No: H3570, (1:1000)) y las membranas de los WBC contaminantes se tiñeron con PE-CD45 (TRITC) (BioLegend – Cat No: 368510 , (1:40)) para la identificación negativa de posibles grupos de CTC en el dispositivo. Primero se tomaron imágenes de los grupos de CTC enriquecidos en el dispositivo como referencia (Fig. 11, i complementaria) y los grupos de CTC en el dispositivo se sometieron posteriormente a un ensayo de viabilidad basado en la integridad de la membrana, NucRed Dead 647 Ready Probes (Thermo Fisher – Cat No: R37113 ), según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se tomaron imágenes de fluorescencia de los grupos de CTC analizados para registrar la fluorescencia del colorante informador de viabilidad (Cy-5) (Figura complementaria 11, ii). Para probar su origen tumoral, las células se fijaron con PFA al 4 %, el dispositivo se colocó dentro de un portafiltros y se aplicó el protocolo de tinción fija utilizando anticuerpos contra la citoqueratina 7, 8/18, vimentina (FITC) y CD45 (Texas Red). y se tomaron imágenes de los grupos con un microscopio de fluorescencia (Figura complementaria 11, iii). Luego, el ensayo de viabilidad se validó analizando los grupos de CTC fijados como control negativo y se tomaron imágenes de los grupos de CTC una vez más con un microscopio de fluorescencia para confirmar un resultado de viabilidad negativo debido a la membrana comprometida de las células fijadas (Figura complementaria 11, iv) .

El ARN se extrajo de las muestras lisadas utilizando el kit Macherey-Nagel Nucleospin RNA XS. El ADNc de doble cadena se generó utilizando el kit de ARN de entrada ultrabaja SMART-Seq v4 de Takara Bio para la secuenciación. A continuación, se generaron bibliotecas de secuenciación compatibles con Illumina con código de barras utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN Illumina Nextera XT con un tiempo de etiquetado reducido de 3 minutos y las muestras se limpiaron con una proporción de perlas de 1:1 para eliminar la presencia de dímeros de cebadores. Las cualidades de las bibliotecas se determinaron en el Agilent Bioanalyzer usando un chip de alta sensibilidad de ADN y las concentraciones se determinaron usando el fluorómetro Invitrogen Qubit. A continuación, las muestras con código de barras se agruparon y secuenciaron en Illumina NextSeq 500 y NovaSeq 6000.

La calidad de los archivos fastq sin procesar se analizó con FASTQC y se recortó con TrimGalore (ref: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) para eliminar las secuencias del adaptador y las lecturas de baja calidad (puntaje Phred mínimo> 24). Las lecturas recortadas se asignaron a la versión hg38 del genoma humano mediante el mapeador STAR (PMID: 23104886) y las transcripciones se cuantificaron mediante el mapeo a la versión de anotación GenCODE.v24 del transcriptoma humano. Para estos grupos de CTC de próstata, se ingresó una mediana de 83,15 M de lecturas al mapeador STAR (rango de 53,7 a 129,79 M) y una mediana de 88,8 % de lecturas asignadas únicamente al transcriptoma humano (rango de 80,57 a 91,59 %). Se detectó un total de 16 412 transcripciones con al menos 10 lecturas asignadas en una muestra y se usó para el análisis DESeq2 en R (PMID: 25516281). Se utilizó un total de 12 149 genes Ensembl mapeados clasificados por DESeq2 log2foldchange como entrada para el análisis GSEA (PMID: 17644558), utilizando la herramienta WebGestalt (PMID: 28472511). Los conjuntos de genes enriquecidos se analizaron utilizando los conjuntos de genes Cancer Hallmark 50 y los conjuntos de genes KEGG Pathway. El análisis t-SNE se realizó en R usando el paquete M3C con semilla = 123 y perplejidad = 1. Los recuentos totales de lectura se normalizaron a valores FPKM usando Cufflinks (PMID: 22383036). Un total de 26 391 transcripciones tenían un FPKM > 1 en al menos una muestra, y 10 885 transcripciones tenían una mediana de FPKM > 1. Para usar en la gráfica del mapa de calor, se generó el recuento de lecturas por millón (RPM) para los genes. Por último, la trama del mapa de calor se generó utilizando la herramienta en línea ClustVis.

Los experimentos de caracterización se realizaron como tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± DE a menos que se indique lo contrario. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios. Los dispositivos fabricados se eligieron aleatoriamente para los experimentos de caracterización y el procesamiento de muestras de pacientes. Las muestras de pacientes se asignaron a diferentes grupos en función del origen de su tumor (próstata frente a ovario). Se usó el enmascaramiento para procesar las muestras de sangre del paciente, donde toda la información del paciente que no sea el tipo de cáncer se retuvo hasta el final del estudio. Los datos de secuenciación de ARN se procesaron mediante canalizaciones bioinformáticas imparciales antes de la evaluación por parte de los autores. Los experimentos representativos mostrados en las Figs. 1b, 2a, 3e y Figs. complementarias. 3b, 9, 10 se realizaron una vez con fines ilustrativos. De manera similar, las Figs. 4a–c, 5a, b y Figs. complementarias. 10, 11a, b corresponden a muestras de pacientes específicos y los experimentos se realizaron una vez en el momento del procesamiento de estas muestras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y en su archivo de información complementaria. Los datos de secuenciación sin procesar y procesados ​​generados en este estudio se han depositado en la base de datos Omnibus de expresión génica (GEO) del NCBI con el código de acceso GSE202650. Los conjuntos de datos disponibles públicamente utilizados en este estudio son conjuntos de genes Hallmark50 [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=H], compilación hg38 del genoma humano [https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.40], base de datos de la ruta KEGG [https://www.genome.jp/kegg/pathway.html], conjunto de genes "CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP" [https://www.gsea- msigdb.org/gsea/msigdb/cards/CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP], conjunto de genes "TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP" [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP]. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Los autores desean agradecer a todos los pacientes y donantes de sangre sanos que participaron en este estudio. Los autores también agradecen al Dr. Anton V. Bryksin y Naima Djeddar de Georgia Tech Molecular Evolution Core, a Sakeenah Hicks, al Dr. Christopher Scharer y a la Dra. Lyra M. Griffiths de Emory Integrated Genomics Core (EIGC) y al Dr. Henry R. Johnston y al Dr. Robert A. Arthur de Emory Integrated Computational Core (EICC) por sus contribuciones en secuenciación de ARN y análisis de datos; y al personal del Georgia Tech Stamps Health Center por su ayuda con la extracción de sangre de donantes sanos. Este trabajo fue apoyado por los fondos iniciales proporcionados a AFS por el Instituto de Tecnología de Georgia. La investigación también fue financiada en parte por la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación del Cáncer de Próstata bajo el Premio No. W81XWH-20-1-0649 (AFS), Georgia Tech Petit Institute Seed Grant (AFS y JFM ), el Premio de Investigación del Cáncer de Próstata del Club de Golf Dunwoody y la Beca Piloto Winship Invest$ del Instituto de Cáncer Winship de la Universidad de Emory (AFS y MAB).

Escuela de Ingeniería Eléctrica e Informática, Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA, EE. UU.

Mert Boya, Tevhide Ozkaya-Ahmadov, Brandi E. Swain, Chia-Heng Chu, Norh Asmare, Ozgun Civelekoglu, Ruxiu Liu, Dohwan Lee y A. Fatih Sarioglu

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Bassel Nazha, Omer Kucuk, Carlos S. Moreno, Mehmet A. Bilen & A. Fatih Sarioglu

Departamento de Hematología y Oncología Médica, Facultad de Medicina de la Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Bassel Nazha, Omer Kucuk y Mehmet A. Bilen

Departamento de Urología, Facultad de Medicina de la Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Martín G. Sanda

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Carlos S. Moreno

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A. Fatih Sarioglu

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MB y AFS diseñaron la investigación y escribieron el manuscrito. MB y RL fabricaron los dispositivos. MB realizó los experimentos. MB y NA desarrollaron el software de análisis. MB y AFS analizaron los datos. ST, LDM, BN, OK, MGS, BBB, MAB y JFM ayudaron con la adquisición de muestras de pacientes. MB, TOA, BES y CHC procesaron y analizaron las muestras de los pacientes. SB ayudó con la preparación de la biblioteca y la secuenciación de ARN. CSM procesó y analizó los datos de secuenciación. TOA, NA, OC y DL contribuyeron a la preparación del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a A. Fatih Sarioglu.

MB y AFS son inventores de una patente presentada por el Instituto de Tecnología de Georgia (solicitud de patente de EE. UU. número 17/619,276). La solicitud de patente cubre la tecnología de aislamiento de grupos CTC desarrollada. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Sunitha Nagrath y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Boya, M., Ozkaya-Ahmadov, T., Swain, BE et al. Aislamiento sin etiqueta de alto rendimiento de grupos de células tumorales circulantes en micropocillos en malla. Nat Comun 13, 3385 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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Recibido: 23 noviembre 2020

Aceptado: 26 de mayo de 2022

Publicado: 13 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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