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Jun 09, 2023

Combi

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4450 (2022) Citar este artículo

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Las terapias contra el cáncer a menudo exhiben solo efectos a corto plazo. Los tumores generalmente desarrollan resistencia a los medicamentos y provocan recaídas que pueden abordarse con combinaciones de medicamentos. La identificación de la combinación correcta es un desafío y se beneficiaría de las pantallas combinatorias de alto contenido y alto rendimiento directamente en las biopsias de los pacientes. Sin embargo, tales pantallas requieren una gran cantidad de material, que normalmente no está disponible para los pacientes. Para hacer frente a estos desafíos, presentamos un flujo de trabajo de microfluidos escalable, llamado Combi-Seq, para examinar cientos de combinaciones de fármacos en gotas de tamaño de picolitros utilizando cambios en el transcriptoma como una lectura de los efectos de los fármacos. Diseñamos un enfoque de código de barras de ADN combinatorio determinista para codificar las condiciones de tratamiento, lo que permite la lectura basada en la expresión génica de los efectos de los medicamentos de una manera altamente multiplexada. Aplicamos Combi-Seq para evaluar el efecto de 420 combinaciones de fármacos en el transcriptoma de las células K562 usando solo ~250 gotitas de células individuales por condición, para predecir con éxito pares de fármacos sinérgicos y antagonistas, así como sus actividades de ruta.

A pesar de los grandes avances en las últimas décadas, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Nuestra mayor comprensión molecular de la base molecular del cáncer ha llevado al desarrollo de terapias dirigidas. Hasta ahora, estas terapias han brindado una eficacia limitada y solo en un pequeño subconjunto de pacientes1, a pesar de los grandes esfuerzos para caracterizar genómicamente a los pacientes para encontrar biomarcadores de respuesta.

Un enfoque que promete mejorar esta situación es complementar el perfilado genómico grande en condiciones basales con mediciones después de perturbar las células cancerosas con fármacos2. Si bien se pueden usar muchos enfoques para realizar exámenes de detección de fármacos, a menudo son de bajo rendimiento3, costo y tiempo extensos4, y/o requieren grandes cantidades de células5, lo que en conjunto restringe fuertemente la cantidad de medicamentos potenciales que se pueden evaluar por biopsia tumoral. Esta limitación se vuelve más pronunciada cuando se consideran combinaciones de medicamentos debido a la gran cantidad de combinaciones potenciales, que aumenta exponencialmente con la cantidad de medicamentos probados.

Debido a las limitadas capacidades de detección, se han desarrollado enfoques computacionales para modelar las interacciones farmacológicas6. Si bien los modelos sobre la eficacia de los medicamentos mejoraron en los últimos años por un aumento en los recursos de datos disponibles, las predicciones sobre las respuestas a los medicamentos siguen siendo un desafío y se limitan a sistemas bien caracterizados, como las líneas celulares, lo que limita su traducibilidad a las clínicas. Entre los diferentes tipos de datos, se demostró que los estados de expresión génica de las células son altamente predictivos de la respuesta al fármaco7. Además, los repositorios de datos de cambios transcripcionales inducidos por fármacos, como LINCS8, han demostrado ser un recurso valioso. Si bien ya existen plataformas de detección de perturbaciones disponibles en placas para transcriptómica a granel9,10 y de una sola célula11,12, por lo general requieren un gran número de células por condición probada y no se han utilizado para la detección de combinaciones de fármacos. Por lo tanto, la integración de lecturas transcriptómicas en una plataforma miniaturizada de detección de fármacos combinatorios con el potencial de detectar biopsias tumorales permitirá predicciones más relevantes y aumentará nuestra comprensión del modo de acción de las interacciones farmacológicas sinérgicas y antagónicas.

La microfluídica basada en gotas, que utiliza gotas de picolitros a nanolitros como recipientes de reacción para realizar pantallas celulares, proporciona un enfoque prometedor para lograr este objetivo. Debido a la miniaturización en varios órdenes de magnitud en comparación con las pantallas convencionales basadas en placas, la cantidad de medicamentos o combinaciones de medicamentos se puede aumentar enormemente mientras se trabaja con un bajo número de celdas de entrada13. Previamente demostramos el primer paso en esta dirección mediante la integración de válvulas Braille en un sistema microfluídico de gotitas para generar combinaciones de fármacos en los llamados tapones (~500 nl de gotitas grandes) almacenados secuencialmente en tubos14. Se usaron tapones para seleccionar directamente 56 opciones de tratamiento combinatorio en biopsias de tumores pancreáticos para encontrar los pares de fármacos más potentes mediante una lectura de apoptosis fenotípica. Si bien nuestro enfoque anterior proporcionó la primera prueba de concepto en la selección directa de material de pacientes, los volúmenes aún relativamente grandes de 500 nl limitaron la cantidad de pares de medicamentos probados. Además, un ensayo de apoptosis proporciona solo una lectura de punto final con información limitada sobre el modo de acción de los pares de fármacos, lo que podría mejorar significativamente nuestra comprensión y la previsibilidad de las combinaciones de fármacos para abordar los mecanismos de resistencia.

Para superar estas limitaciones, presentamos aquí una plataforma de microfluidos que permite realizar pantallas altamente multiplexadas de cientos de combinaciones de fármacos en una emulsión de gotitas del tamaño de un picolitro. Mediante la introducción de un enfoque de código de barras combinatorio determinista, en el que conjuntos de dos códigos de barras codifican pares de fármacos, logramos detectar todas las condiciones de una manera altamente multiplexada, sin necesidad de mantener ningún orden espacial (p. ej., pocillos, secuencia de tapones). Dado que los códigos de barras de ADN se diseñaron para el análisis completo del transcriptoma de las células después de la perturbación del fármaco, también pudimos realizar perfiles basados ​​en la expresión génica masivamente paralelizados de combinaciones de fármacos. Demostramos que el enfoque Combi-Seq presentado se puede aplicar para determinar el impacto de los fármacos en la viabilidad celular y la señalización celular, proporcionando así un enfoque de alto rendimiento para descubrir pares de fármacos sinérgicos y descifrar su modo de acción.

Se realizaron cribados de fármacos combinatorios multiplexados en gotitas unicelulares encapsulando fármacos junto con fragmentos de código de barras de ADN (Fig. 1a). Cada combinación de fármacos por pares fue codificada por una combinación única de dos fragmentos de código de barras de ADN, que juntos proporcionaron un sitio de cebado para la transcripción inversa (poli-dT) y la PCR. Después de la incubación fuera del chip de las gotas, se agregaron a cada gota reactivos para la lisis celular, la ligadura de fragmentos de código de barras y la transcripción inversa mediante picoinyección15. La unión de dos fragmentos de código de barras (BC-RT y BC-PCR) dio como resultado códigos de barras funcionales, que codifican combinaciones de fármacos por pares (Fig. 1). Dado que los códigos de barras se utilizaron para la transcripción inversa del ARNm liberado de las células lisadas, los transcriptomas se codificaron según los tratamientos farmacológicos (Fig. 1b). Posteriormente, se extrajo ADNc con código de barras de las gotitas para construir una biblioteca de secuenciación (Fig. 1 complementaria). Finalmente, se realizó la secuenciación para demultiplexar las condiciones de tratamiento y analizar sus efectos sobre la expresión génica.

a Resumen del flujo de trabajo de Combi-Seq: (1) Las células se encapsularon con combinaciones de fármacos y pares de fragmentos de código de barras que codifican fármacos. (2) Después de la incubación fuera del chip, las gotas se reinyectaron en un chip para la picoinyección para agregar reactivos para la ligadura de códigos de barras y la transcripción inversa (RT), lo que permitió la codificación de barras del transcriptoma de acuerdo con el tratamiento farmacológico. (3) Tras la rotura de las gotas, se generaron bibliotecas agrupadas para la secuenciación en las que las células del mismo grupo de tratamiento comparten el mismo código de barras. Esto facilitó la demultiplexación de los tratamientos farmacológicos y las lecturas basadas en la expresión génica para grupos de 250 células. b Estrategia de código de barras aplicada para codificar y decodificar combinaciones de fármacos para grupos de células de entrada baja. Pares de cebadores de PCR con código de barras (BC-PCR) y cebadores de poli-dT con código de barras (BC-RT) se unieron en una reacción de ligación para formar códigos de barras funcionales, que se usaron para la transcripción inversa, codificando así una combinación de dos fármacos. Al romper las gotas, el ADNc con código de barras se puede recuperar y amplificar para la secuenciación. c Canalización de microfluidos utilizada para generar combinaciones de fármacos en gotitas. (1) Se utilizaron válvulas Braille para generar secuencias de 20 tapones de código de barras de fármacos (BC-RT) dentro del tubo de retardo. El tubo de retardo se conectó a un generador de gotas (2) en el que se inyectaron mezclas de células y fármacos-BC-PCR de placas de pocillos múltiples. Finalmente, al inyectar los tapones en el fabricante de gotas abriendo dos válvulas de aceite, se generaron gotas que contenían pares de medicamentos con códigos de barras y células. M1–M3 indican las posiciones donde se adquirieron las señales de fluorescencia. d Generación de tapones de código de barras de fármaco en la tubería de retardo: (1) Se produjeron tapones separados por aceite abriendo secuencialmente las válvulas correspondientes, (2) lo que resultó en una secuencia de 20 tapones de código de barras de fármaco. (3) Al abrir dos válvulas de aceite, los tapones del tubo de retardo se inyectaron en el chip generador de gotas. e Producción de gotas a partir de una suspensión celular, tapones de fármaco-código de barras y mezclas de fármaco-código de barras inyectadas por el muestreador automático, lo que resulta en la coencapsulación de células con combinaciones de fármaco-código de barras. f Esquema que ilustra la generación de combinaciones de fármacos a partir de 20 fármacos del módulo de válvula con fármacos de una placa de 96 pocillos. Cada secuencia de 20 tapones de código de barras de fármaco (BC-RT) se combinó con mezclas de código de barras de fármaco (BC-PCR) de un pozo.

Para generar combinaciones de fármacos en gotitas del tamaño de un picolitro, sincronizamos el sistema de válvula Braille y la inyección de fármacos basada en un muestreador automático en un chip fabricante de gotitas (Fig. 1c). Además, se inyectaron suspensiones celulares en el chip fabricante de gotas a una densidad de 0,1 células por volumen de gota, para obtener gotas que contenían células individuales (Película complementaria 1). El muestreador automático (Dionex) se cargó con una placa de 96 pocillos, cada uno de los cuales contenía un solo fármaco junto con el fragmento de cebador con código de barras correspondiente (BC-PCR) y un colorante marcador que permitía controlar los pasos de mezcla posteriores. Los fármacos se aspiraron consecutivamente y se inyectaron en el generador de gotas. Se usó la ventana de tiempo entre dos muestras del muestreador automático (~3 min) para generar una secuencia de 20 tapones químicamente distintos, cada uno con pares únicos de dos fármacos y dos fragmentos de código de barras (BC-RT y BC-PCR), inyectando medicamentos secundarios y códigos de barras (BC-RT) en un chip de válvula Braille separado (Fig. 1c y Fig. 2a complementaria). En particular, cada válvula compuesta se abrió secuencialmente y se inyectó aceite fluorado en el medio para que los tapones de código de barras del fármaco espaciados por una fase de aceite inmiscible pudieran inyectarse en un tubo de retardo (Fig. 1d). Una vez que la tubería de retardo se llenó con una secuencia de 20 tapones, se abrieron dos válvulas de aceite para inyectar todos los tapones en el generador de gotas (~ 2 min, Fig. 2b complementaria).

Por lo tanto, los tapones de código de barras de fármaco del sistema de válvula se combinaron con las mezclas de código de barras de fármaco que se inyectaron desde el muestreador automático y se encapsularon junto con células individuales en gotitas (Fig. 1e). Al repetir este proceso, se generaron cientos de combinaciones con pares específicos de fragmentos de códigos de barras (Fig. 1f). Es importante tener en cuenta que se puede aumentar el número de combinaciones aumentando el número de fármacos inyectados desde el muestreador automático.

La sincronización entre el muestreador automático y la inyección de fármacos basada en válvulas fue crucial para garantizar que las combinaciones solo se generaran una vez que el fármaco inyectado desde el muestreador automático hubiera alcanzado su concentración máxima. Entre cada fármaco proveniente del muestreador automático, se observó una ventana de tiempo con concentraciones crecientes y decrecientes, como lo muestra la inyección alterna de colorantes fluorescentes (Fig. 2a). Este fenómeno se basa en la dispersión de solutos de Taylor-Aris en la fase portadora miscible y continua (PBS) del muestreador automático16. No se generaron combinaciones durante esa ventana de tiempo, que se utilizó más bien para producir tapones compuestos en el tubo de retardo del módulo Braille. . Una vez que se alcanzó la concentración de meseta, como se indica al medir una intensidad constante de un colorante marcador fluorescente, los 20 tapones compuestos se inyectaron en el generador de gotas y se combinaron con el fármaco del muestreador automático y las células en gotas. La inyección de uno de esos trenes de enchufes tomó 2 minutos, lo que resultó en un tiempo total (producción e inyección de enchufes) de 15 segundos para generar ~2500 gotitas que contenían células y una condición de tratamiento combinatorio con código de barras. Una vez que se inyectaron los 20 tapones, el muestreador automático comenzó a aspirar el fármaco subsiguiente.

una inyección alterna de Alexa-488 o Cascade-Blue desde una placa de 96 pocillos utilizando el muestreador automático. Las muestras que se inyectaron en la ventana de tiempo de disminución y aumento de las señales de fluorescencia (recuadro gris) se descartaron asegurándose de que no se generaran combinaciones. Dado que no se inyectaron tapones de código de barras de drogas de la pantalla Braille durante las ventanas de tiempo con concentraciones inestables (recuadro gris), las gotas solo contenían códigos de barras no funcionales (BC-PCR). Se utilizaron ventanas de tiempo con señales de fluorescencia estables (recuadro azul) para generar combinaciones de fármacos mediante la coinyección de 20 tapones generados en el chip de pantalla Braille que dieron como resultado códigos de barras funcionales. b Intensidades de fluorescencia de una secuencia de enchufe de las válvulas Braille complementadas con Alexa-488 o Cascade-Blue medidas en la posición M1 (= antes de la mezcla combinatoria). La superposición azul que conecta (a) y (b) ilustra una serie temporal durante la cual se combina un ciclo de 20 tapones (el segundo tapón sin colorante de referencia) con una muestra del muestreador automático. Se utilizaron secuencias alternas de fármacos suplementados con Cascade-Blue o Alexa-488 para cuantificar la contaminación cruzada entre tapones positivos fluorescentes específicos (p. ej., verde) en la muestra negativa posterior (p. ej., azul) para ambos modos de inyección, por separado. c Contaminación cruzada de enchufes positivos verdes a enchufes negativos verdes de la pantalla Braille (11 ciclos como se muestra en b). d Contaminaciones cruzadas de tapones para tres chips diferentes: se analizó la relación entre las intensidades de fluorescencia de un tapón negativo azul o verde y el tapón positivo azul o verde anterior para cuantificar el nivel de contaminación cruzada entre muestras secuenciales (n = 99, n = 80 y n = 171, respectivamente). e Señales de fluorescencia de gotas que contienen mezclas combinatorias. Diagrama de dispersión que representa las intensidades de fluorescencia medidas para las gotas generadas solo a partir de tapones etiquetados con Cascade-Blue y solo Alexa-488 inyectado desde el muestreador automático, medido en la salida de la gota (n = 91 899). f Señales de fluorescencia de gotas de (e) mostradas para 180 combinaciones individuales. Los colores representan ciclos de 20 tapones de fármacos combinados con un fármaco del muestreador automático. Los diagramas de caja muestran la mediana y los cuartiles primero y tercero como una caja, y los bigotes indican los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 longitudes de la caja. M1–M3 indican posiciones como se muestra en la Fig. 1c. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para garantizar el contenido de las gotas con contaminación cruzada marginal, diseñamos la geometría y los conectores de los tubos de retardo de los chips de fabricación de gotas de la válvula Braille de modo que no quedaran mezclas residuales de código de barras y medicamentos en los canales (Fig. 3 complementaria). Antes de cada experimento, medimos un indicador del nivel de contaminación entre los enchufes de la pantalla Braille. Esto se hizo mediante el uso de medicamentos complementados alternativamente con Alexa-488 o Cascade-Blue, lo que resultó en una secuencia alterna de picos de fluorescencia azul y verde (Fig. 2b). Las intensidades de fluorescencia de los tapones se midieron en el generador de gotas y las contaminaciones de fármacos/colorantes de un tapón al tapón subsiguiente se detectaron mediante señales verdes en picos UV o señales UV en picos verdes (Fig. 2c).

La relación entre las señales de fluorescencia de cada pico negativo (n) en el canal verde o UV con el pico positivo anterior (n-1) se usó como proxy para cuantificar el nivel de contaminación cruzada entre dos fármacos (Fig. 2d ). En tres configuraciones de chips diferentes (válvula Braille y fabricante de gotas), encontramos una media de 1,5 % de contaminación en el canal UV y 0,7 % en el canal verde (Tabla complementaria 1), lo que indica que los sistemas descritos se pueden aplicar para generar combinaciones con una pureza suficientemente alta.

En la canalización microfluídica descrita, las combinaciones de fármacos se generaron mezclando fármacos inyectados desde un muestreador automático y un módulo de válvula Braille. Para garantizar concentraciones de fármaco precisas y precisas dentro de las gotas, ambos fármacos debían encapsularse en una proporción constante y predefinida. Validamos la mezcla precisa de dos fármacos complementando todos los compuestos de la pantalla Braille con Cascade-Blue y todos los compuestos del muestreador automático con Alexa-488. Observamos una población principal altamente densa de gotas dobles positivas dobles azules y verdes, lo que demuestra que ambos compuestos se coencapsularon en una proporción constante (Fig. 2e). Además, confirmamos la coencapsulación estable de los dos colorantes para gotitas en combinaciones individuales (Fig. 2f). Las intensidades de fluorescencia medianas de las combinaciones individuales fueron muy estables con coeficientes de variación (CV) sobre 180 combinaciones de 2,9 y 3 % para las intensidades azul y verde, respectivamente. La dispersión de gotas alrededor de la población principal puede explicarse por una fase de equilibrio de flujo corta (<100 ms) al principio y al final de los tapones y la fluctuación de la trayectoria de la gota dentro de un rayo láser enfocado (Figura 4 complementaria y Película complementaria 2) . En consecuencia, llegamos a la conclusión de que los modos de inyección (válvula Braille o muestreador automático) se pueden sincronizar de manera robusta para generar combinaciones de fármacos en gotas con alta precisión y pureza.

Para caracterizar la tubería de microfluidos y demostrar su aplicabilidad para realizar pantallas de drogas combinatorias basadas en la expresión génica, diseñamos una pequeña pantalla de drogas 4 × 4 (Tabla 1). En primer lugar, queríamos evaluar si el modo de inyección de medicamentos de las válvulas Braille frente al muestreador automático causaba algún sesgo y, por lo tanto, cargaba el mismo conjunto de medicamentos en las válvulas Braille y el muestreador automático. En caso de un sesgo de inyección, esperaríamos ver diferencias entre la misma combinación generada en orden inverso (p. ej., Imatinib y Trametinib frente a Trametinib e Imatinib). En segundo lugar, nuestro objetivo era evaluar el impacto del modo de código de barras en la lectura de la expresión génica. Para este propósito, primero codificamos las condiciones de tratamiento de modo que los medicamentos inyectados desde las válvulas Braille se complementaron con BC-RT con código de barras, mientras que los medicamentos del muestreador automático se complementaron con BC-PCR. Luego, repetimos el experimento con medicamentos de codificación BC-RT del muestreador automático y medicamentos de codificación BC-PCR de las válvulas Braille, esperando resultados comparables si el modo de código de barras no afecta las lecturas. Usamos la tubería descrita para generar gotitas, cada una de las cuales contenía células K562 de leucemia humana individuales y todas las combinaciones por pares de medicamentos y los códigos de barras correspondientes, e incubamos la emulsión durante 12 h. Después de la ligación, los dos fragmentos de cebador con código de barras formaron un código de barras funcional que codificaba la combinación de fármacos por parejas. Para obtener tres repeticiones, todo el proceso se realizó tres veces.

Cada código de barras ligado se usó para transcribir inversamente los transcriptomas de las células perturbadas (Fig. 1a). Después del preprocesamiento de datos (métodos de preprocesamiento de datos de expresión génica) y los controles de calidad iniciales (mediana de lectura y recuento de genes por muestra de 3,47 × 105 y 3229, respectivamente, figura complementaria 5), ​​realizamos una reducción de la dimensión utilizando incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t -SNE, Fig. 3a) sobre la matriz de recuento demultiplexada. Para analizar si surge algún sesgo sistemático en función de la fuente de inyección (automuestreador o válvulas Braille), analizamos las muestras según el fármaco del muestreador automático (Fig. 3a, panel superior izquierdo), el fármaco de las válvulas Braille (Fig. 3a, panel superior derecho) , la combinación de fármacos "ordenada" (donde hicimos una distinción entre, por ejemplo, imatinib-trametinib y la combinación de trametinib-imatinib), y la combinación de fármacos "desordenada" (donde no se distinguieron las muestras de imatinib-trametinib y trametinib-imatinib). Mientras que el modo de inyección para medicamentos individuales del muestreador automático (Fig. 3a, panel superior izquierdo) o las válvulas Braille (Fig. 3a, panel superior derecho) tiene solo un impacto moderado en la agrupación de puntos de datos individuales, sus combinaciones por pares (Fig. 3a, paneles inferiores) es el determinante más fuerte de la cohesión y separación entre muestras.

a Gráficos TSNE de datos de expresión génica normalizados. Las muestras están codificadas por colores según el fármaco del Automuestreador (panel superior izquierdo), el fármaco de las válvulas Braille (panel superior derecho), la combinación ordenada (panel inferior izquierdo) y la combinación desordenada (panel inferior derecho). El código de color está etiquetado para los medicamentos con válvulas Braille y automuestreador (paneles superiores). b Puntuaciones de silueta de agrupamiento de muestras basadas en fármacos de válvulas Braille/muestreador automático y combinaciones ordenadas/no ordenadas. Las puntuaciones de las siluetas se comparan con distribuciones aleatorias (código de color) creadas permutando etiquetas de muestra. c Mapa de calor de la actividad de la ruta de las muestras. Se calcularon las actividades de la vía PROGENy para cada muestra (puntuaciones z de las actividades de la vía, código de color), y la matriz de actividad de la vía se agrupó jerárquicamente. Los fármacos de las combinaciones están codificados por colores (verde claro: fármaco del muestreador automático, azul: fármaco de las válvulas Braille, cian: el mismo fármaco del muestreador automático y las válvulas Braille). d Cambios en la actividad de la vía inducidos por fármacos. Se ajustó un modelo lineal (pathway_activity ~YM155 + Imatinib + Trametinib) para cada vía, y los coeficientes del modelo lineal (código de colores) para cada fármaco se trazan como un mapa de calor. e Cambios en la actividad de MAPK inducidos por fármacos. Actividad de MAPK (eje y) agrupada según el fármaco del muestreador automático (eje x) y el fármaco de las válvulas Braille (código de color), n = 3 experimentos biológicos independientes para todas las muestras, excepto YM155_Imatinib y DMSO_Imatinib n = 2. Los diagramas de caja muestran la mediana y el primer y tercer cuartiles como un cuadro, y los bigotes indican los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 longitudes del cuadro. f Correlación de las actividades de la vía MAPK entre dos pantallas de 4 × 4, realizadas con asignaciones de códigos de barras intercambiadas (r = 0,637, p = 0,01 y R2 = 0,406), el área sombreada muestra un intervalo de confianza del 95 % de la estimación de regresión. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para cuantificar aún más el alcance de la agrupación de muestras en función de la fuente de inyección para combinaciones ordenadas y desordenadas, realizamos un análisis de silueta (Fig. 3b, y control de calidad de los datos de expresión génica basado en la agrupación de métodos). Como la distribución de los puntajes de silueta depende del número de grupos (4 para drogas, 16 para combinaciones desordenadas y 10 para combinaciones ordenadas), comparamos los puntajes de silueta de agrupamiento con distribuciones aleatorias creadas permutando las etiquetas de muestra. Los puntajes de silueta para medicamentos individuales y combinaciones fueron significativamente más altos (valores de p <0,01) que las distribuciones de fondo, lo que demuestra que las muestras se agrupan en función de los medicamentos y combinaciones utilizados. En consecuencia, el modo de código de barras para fármacos individuales inyectados desde las válvulas Braille o el muestreador automático codificado con cebadores de RT o PCR con código de barras no introduce un sesgo, ya que su impacto en la agrupación y, por lo tanto, en la expresión génica, es indistinguible. Contrariamente a esto, las combinaciones por pares fueron impulsadas por la agrupación de las muestras, lo que demuestra que ambos fármacos se detectaron juntos de manera imparcial. También realizamos un agrupamiento jerárquico utilizando los 100 genes más expresados ​​en las muestras, que también mostró un agrupamiento de las muestras basado en fármacos y combinaciones (Fig. 6 complementaria). Además, las muestras tratadas generalmente se separaron bien de los controles de DMSO en un análisis de componentes principales (PCA, Fig. 7 complementaria). Para demostrar aún más que nuestra tubería experimental no presenta sesgos técnicos significativos, realizamos la pequeña pantalla 4 × 4 con códigos de barras intercambiados (medicamentos de válvulas Braille complementados con BC-PCR y medicamentos de automuestreador complementados con BC-RT). Observamos una calidad similar (Fig. 8 complementaria) y la agrupación de muestras en función de tSNE y los 100 genes expresados ​​​​principales (Figs. 9a, b, 10 complementarias).

Para analizar más a fondo las firmas de expresión génica de las células tratadas con diferentes combinaciones, calculamos los cambios en la actividad de la ruta para cada muestra, utilizando el método PROGENy17,18,19. PROGENy calcula las actividades de las vías a partir de los datos de expresión génica para 14 vías relacionadas con el cáncer. El agrupamiento jerárquico de muestras basado en las actividades de la vía (Fig. 3c) también mostró el agrupamiento basado en fármacos y combinaciones. Observamos dos grupos principales, uno correspondiente a combinaciones que incluían YM155, mientras que el otro estaba dominado por muestras tratadas con Trametinib. Al analizar las asociaciones entre los cambios en la actividad de las vías y los fármacos (Fig. 3d), encontramos una disminución de la actividad de la vía de la hipoxia en todas las muestras tratadas con YM155, mientras que todas las muestras tratadas con Trametinib (inhibidor de MAPK) mostraron una fuerte inactivación de MAPK (Fig. 3e, pág. valor de un modelo lineal: 0,03) y vías de EGFR relacionadas. Además, al correlacionar los puntajes de actividad de la vía MAPK de la pantalla pequeña de 4 × 4 (Fig. 3e) y la pantalla de 4 × 4 intercambiada (Fig. 9e complementaria), encontramos una correlación significativa (r = 0.637, p = 0.01), demostrando la detección reproducible de las actividades de la vía (Fig. 3f). El análisis de la vía sugiere que los cambios en la expresión génica observados corresponden al mecanismo de acción conocido de los fármacos usados, que detallamos más adelante en la discusión. En resumen, los resultados respaldan el uso de nuestro método de detección para analizar los cambios de expresión génica inducidos por combinación de una manera de alto rendimiento, lo que permite la caracterización de las respuestas a los fármacos con mucho más detalle en comparación con los ensayos fenotípicos utilizados anteriormente14.

Para evaluar la solidez de la canalización de Combi-Seq, comparamos las actividades de la ruta de la pantalla de drogas Combi-Seq 4 × 4 en gotitas con las actividades de la misma pantalla realizada en una placa multipocillo (recuento de lectura promedio 1,07 × 106). El agrupamiento jerárquico de correlaciones entre las actividades de la vía a partir de datos a granel (Fig. 11 complementaria) y de gotas (Fig. 3c) dio como resultado dos grupos principales impulsados ​​​​por correlaciones positivas en las actividades de la vía: para ambos formatos, un grupo se formó por correlaciones positivas entre YM155 tratados y el otro grupo fue impulsado por correlaciones positivas de los tratamientos con Imatinib (Fig. 4a). Por lo tanto, pudimos demostrar que las pantallas de drogas basadas en gotitas de entrada baja que utilizan secuenciación superficial como lectura capturan las características principales de los datos de secuenciación profunda de entrada alta a granel en el nivel funcional de las actividades de la vía. Además, comparamos la estrategia de codificación de barras Combi-Seq con la captura de ARNm convencional basada en poliA (PolyA) en formato masivo. La expresión génica entre los datos de Combi-Seq y PolyA mostró coeficientes de correlación entre 0,576 y 0,646 (Fig. 12 complementaria), comparables con los resultados de comparaciones anteriores de diferentes enfoques de secuenciación de RNA-Seq (p. ej., Prime-Seq frente a True-Seq: R2 = 0.64)20, lo que sugiere que el enfoque Combi-Seq no introduce sesgos importantes durante los pasos de preparación de la biblioteca.

un mapa de calor de las correlaciones entre las actividades de la ruta de los datos Combi-Seq a granel y de gotas: se determinaron las actividades de la ruta PROGENy para cada muestra y se calcularon las correlaciones para las muestras emparejadas utilizando los datos obtenidos en placas de microtitulación (filas) o gotas (columnas) (código de color azul a rojo) y se utiliza para realizar la agrupación jerárquica. Los fármacos de las combinaciones están codificados por colores (verde claro: fármaco del muestreador automático, azul: fármaco de las válvulas Braille, cian: el mismo fármaco del muestreador automático y las válvulas Braille). b Precisión de la detección de picos como una correlación entre la concentración de entrada de ERCC y las transcripciones medidas por millón (TPM) para 250 células por muestra, el área sombreada muestra el intervalo de confianza del 95 % de la estimación de regresión. (c) Resumen de los coeficientes de correlación para 125 (R = 0,63 y R2 = 0,40), 250 (R = 0,65 y R2 = 0,42) y 500 células (R = 0,7 y R2 = 0,49) por muestra, n = 5 experimentos biológicos independientes , los datos se presentan como valores medios ± intervalo de confianza del 95 %. d Sensibilidad como la probabilidad de detección de moléculas adicionales para 250 células por muestra. Se consideró que se había detectado un repunte cuando la probabilidad alcanzaba el 50 %. e Resumen de sensibilidades para diferentes cantidades (125, 250 y 500) de células por muestra, n = 5 experimentos biológicos independientes, los datos se presentaron como valores medios ± intervalo de confianza del 95 %. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para probar la sensibilidad y la precisión del enfoque Combi-Seq, también utilizamos una biblioteca de 92 secuencias de ADN diferentes del Consorcio de Controles de ARN Externo (ERCC). Introducimos moléculas de ERCC en gotitas y analizamos la precisión (Fig. 4b, correlación entre la concentración de la molécula de ERCC y la expresión medida) y la sensibilidad (Fig. 4d, el umbral para la detección de moléculas de ERCC). Observamos una precisión creciente (Fig. 4c, 0.63, 0.65, 0.7 correlación de Pearson para 125, 250 y 500 celdas de entrada, respectivamente) y sensibilidad (Fig. 4e, 2.55, 2.06 y 1.48 log10 (attomoles/ul) límite de detección para 125, 250 y 500 celdas de entrada, respectivamente) del método Combi-Seq con mayor material de entrada (número de celdas por gota, donde la cantidad de complementos de ERCC agregados aumentó proporcionalmente al número de celdas). Estos resultados están dentro del rango de otros enfoques de RNA-Seq de bajo aporte21.

Con base en los prometedores resultados del experimento de combinación de fármacos 4 × 4, realizamos una pantalla de alto rendimiento, utilizando un total de 420 condiciones de tratamiento combinatorias diferentes. Para este estudio, seleccionamos deliberadamente medicamentos con valores de logD bajos (Figura 13 complementaria y Datos complementarios). De esta forma, se puede minimizar el intercambio no deseado de compuestos típicamente hidrófobos22. Además, realizamos una serie de experimentos sistemáticos para probar si el intercambio de drogas afecta nuestra lectura. En particular, mezclamos gotitas que contenían solo un fármaco y células (tratadas) con gotitas que contenían solo DMSO y células (controles de DMSO) y las incubamos durante 24 h a 37 ° C (Fig. 14a complementaria). Además, las gotas con DMSO y las células se incubaron y procesaron por separado como control positivo para un fenotipo no tratado (controles de DMSO separados). Posteriormente, las células se lisaron y los códigos de barras se ligaron para realizar la transcripción inversa para la secuenciación del transcriptoma completo (Fig. 14b complementaria). Las proyecciones de los datos usando UMAP, separaron las muestras tratadas de las de control de DMSO, y la mayoría de las muestras de control de DMSO se agruparon juntas (Fig. 14c complementaria). Esto indica que durante un período de incubación de 24 h, el efecto de los fármacos solo se puede observar en las gotitas que contenían el fármaco en primer lugar, pero no en las gotitas que contenían solo DMSO. De manera convincente, las muestras de DMSO sin tratar que se incubaron con gotitas que contenían fármacos se agruparon bien con los controles de DMSO que se manipularon por separado, incluso para fármacos con valores LogD positivos como Imatinib. Con el fin de estimar las concentraciones óptimas de fármacos para las pantallas combinatorias a gran escala, generamos curvas de dosis-respuesta utilizando células K562 para determinar sus valores de inhibición del crecimiento (GR) del 35 % para cada fármaco individual. En comparación con la métrica tradicional, el valor IC50, el GR50 (o, en nuestro caso, el GR35) no es sensible al número de divisiones que se producen durante los tratamientos farmacológicos, que pueden variar según las líneas celulares y las condiciones (Datos complementarios) 23 Los medicamentos se asignaron a las válvulas Braille o al muestreador automático para lograr una distribución equilibrada de medicamentos con valores altos y bajos de GR35. Los fármacos cargados en las válvulas Braille o en el muestreador automático se complementaron con BC-RT o BC-PCR, respectivamente. Nuestro objetivo era generar 250 gotas que contenían una sola célula para cada una de las 420 condiciones de tratamiento e incubar gotas durante 12 h a 37 ° C antes de realizar la picoinyección para la lisis celular, ligaduras de códigos de barras y RT (Fig. 1a). Este proceso se realizó tres veces para obtener réplicas.

Después del preprocesamiento inicial y el control de calidad (mediana de lecturas y genes por muestra de 32892 y 547, respectivamente, Fig. 15 complementaria), realizamos la misma reducción de dimensionalidad (Fig. 5a) y análisis de silueta (Fig. 5b), como para los 4 pantalla × 4. Nuevamente, las muestras se agruparon significativamente mejor en función de la combinación utilizada, de lo que se esperaba al azar (valores de p de las puntuaciones de la silueta frente a la distribución aleatoria: <0,01, 0,47 y <0,01 para el fármaco del muestreador automático, el fármaco de las válvulas Braille y la combinación, respectivamente). También descubrimos que el bajo número de células no afectó la capacidad de distinguir las células tratadas de las no tratadas en función de la expresión génica (Fig. 16a complementaria).

a Gráficos TSNE de datos de expresión génica normalizados. Las muestras tratadas con la combinación YM155 (panel izquierdo), blebbistatina (panel central) y YM155-blebbistatina se etiquetan como ejemplos representativos. b Puntuaciones de silueta de agrupación de muestras basadas en fármacos y combinaciones de muestreadores automáticos/válvulas Braille. Las puntuaciones de las siluetas se comparan con distribuciones aleatorias (código de color) creadas permutando etiquetas de muestra. ( c ) Análisis ROC de la similitud de la firma del fármaco con los datos de LINCS-L1000. Para cada fármaco, se calculó una firma de consenso y se calculó la similitud (correlación de rango de Spearman) con las firmas LINCS-L1000 correspondientes. Los valores de similitud se usaron como valores predichos para el análisis ROC, mientras que los verdaderos positivos fueron los pares de fármacos coincidentes entre la pantalla de alto rendimiento y LINCS-L1000. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar más a fondo si los valores de expresión génica de la pantalla de alto rendimiento son biológicamente significativos, comparamos las firmas de expresión génica obtenidas con las disponibles para los mismos medicamentos en el conjunto de datos público LINCS-L10008. Dado que LINCS-L1000 solo contiene firmas de expresión de tratamientos farmacológicos de monoterapia, calculamos las firmas de consenso para cada fármaco de nuestra pantalla de alto rendimiento (Métodos Análisis genómico funcional de las firmas de expresión génica) y las comparamos con las firmas de consenso generadas a partir de la base de datos LINCS-L1000 a través de todas las líneas celulares y dosis de concentración disponibles (tenga en cuenta que LINCS-L1000 no incluye datos obtenidos directamente de las células K562). Para 32 medicamentos utilizados en nuestra pantalla de microfluidos, estaban disponibles los datos correspondientes en LINCS-L1000. Para comparar las similitudes de firma de estos, calculamos los coeficientes de correlación de Spearman para todos los pares de medicamentos en los dos conjuntos de datos. Nuestro análisis ROC mostró que las firmas de los mismos medicamentos de las dos pantallas (positivos verdaderos) son más similares que las firmas de pares de medicamentos no relacionados (Fig. 5c, ROC AUC: 0.59), y esta área bajo la curva ROC es estadísticamente significativa en comparación a una distribución aleatoria creada por la permutación de las etiquetas de los medicamentos (Fig. 17 complementaria, p = 0.019).

En conjunto, demostramos que para la detección combinatoria de drogas de alto rendimiento, la inyección (válvula Braille o muestreador automático) y el modo de código de barras no sesgaron los datos y que la correlación de firmas de drogas entre nuestros datos y LINCS-L1000 mostró una similitud significativa. En consecuencia, llegamos a la conclusión de que nuestro enfoque Combi-Seq se puede aplicar para realizar exámenes de detección combinatorios de fármacos a gran escala utilizando material de entrada bajo y secuencias de ARN poco profundas como lectura.

Como todas las concentraciones de fármaco usadas eran valores de GR35, esperábamos que las combinaciones sinérgicas pudieran conducir a una disminución de la viabilidad celular, mientras que en el caso de las combinaciones antagónicas, esperábamos valores de viabilidad celular aumentados. Si bien no medimos la viabilidad celular directamente, el algoritmo CEVIChE (Métodos de análisis genómico funcional de las firmas de expresión génica)18 nos permitió inferir cambios en la viabilidad celular para todas las combinaciones de fármacos utilizados a partir de los datos de expresión génica (Fig. 18 complementaria), que funcionó sólidamente para números bajos de células y fue independiente del porcentaje de genes mitocondriales detectados (Figs. 16b, 19 complementarios). Al comparar las viabilidades disminuidas previstas entre las combinaciones de fármacos y los tratamientos con un solo fármaco, determinamos las puntuaciones de sinergia para las 420 combinaciones (Fig. 6a). Encontramos varios grupos de posibles combinaciones sinérgicas y antagónicas (p. ej., triciribina-dacarbazina y razoxano-trametinib, respectivamente). Para validar experimentalmente las predicciones sobre la sinergia de la detección de fármacos de alto rendimiento, realizamos pantallas de viabilidad celular combinatorias de matriz de dosis de 5 × 5 con todas las combinaciones posibles de triciribina, YM155, razoxano y doxorrubicina con dacarbazina, imatinib y trametinib en un microtítulo. formato de placa.

un mapa de calor que muestra las puntuaciones de sinergia predichas que se determinaron comparando las viabilidades de las 420 combinaciones de fármacos con los correspondientes tratamientos con un solo fármaco. b Correlación entre la viabilidad celular experimental y prevista (correlación de Pearson r = 0,66, p = 0,018, R2 = 0,44). La sinergia de fármacos (eje y) se midió para 12 combinaciones en un formato de placa de microtitulación (código de color) y se graficó frente al valor de sinergia predicho (eje x), el área sombreada muestra un intervalo de confianza del 95 % de la estimación de regresión. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Calculamos las puntuaciones de sinergia (positivas: sinérgicas, negativas: antagónicas) para las 12 combinaciones probadas utilizando el modelo de sinergia de independencia de Bliss (métodos de medición de viabilidad basados ​​en placas para validar los resultados de la pantalla de microfluidos)24. Entre las 12 combinaciones validadas, el antagonismo fue más común, lo que es comparable a los datos publicados previamente (Figura 20 complementaria). Nuestras 12 sinergias medidas (experimento en placa) y predichas (a partir de los datos de expresión génica obtenidos en el sistema de microfluidos) mostraron una correlación significativa (Fig. 6b, correlación de Pearson r = 0,66, p = 0,018, consulte la Tabla complementaria 2 para valores sin Razoxane-Trametinib ). La comparación confirmó que las combinaciones de trametinib e inhibidores de la topoisomerasa 2 muestran efectos antagónicos, mientras que la inhibición de BCR-ABL (imatinib) actúa en sinergia con una mayor inducción de apoptosis al inhibir la survivina con YM155, lo que confirma aún más el potencial de descubrimiento de nuestra plataforma Combi-Seq.

En resumen, utilizando nuestra plataforma de expresión génica microfluídica combinatoria, demostramos que (i) los valores de expresión génica medidos se agrupan en función de la perturbación química, (ii) los datos resultantes concuerdan bien con los perfiles de perturbación de monoterapia públicos, y (iii) Las viabilidades celulares predichas y las sinergias farmacológicas podrían validarse en un formato de placa multipocillo para aciertos seleccionados. En conjunto, esto ilustra cómo se puede obtener información completa de los perfiles de expresión génica obtenidos en un formato microfluídico altamente multiplexado, secuenciando solo alrededor de 250 células por tratamiento farmacológico. Esto debería hacer que el flujo de trabajo sea particularmente interesante para su uso con material muy limitado, como muestras de pacientes.

Se ha demostrado que la estratificación de los pacientes con cáncer para personalizar los tratamientos con quimioterapia y fármacos dirigidos aumenta el éxito de las terapias contra el cáncer25,26,27. Estos esfuerzos están impulsados ​​en gran medida por la disección del panorama genómico y transcripcional de los tumores o las líneas celulares para identificar los rasgos que explican las sensibilidades a los fármacos28,29. Si bien una variedad de marcadores genómicos y/o transcriptómicos identificados se utilizan con éxito en las clínicas, están disponibles solo para un pequeño subconjunto de tipos de tumores y pacientes1. Además, muchos pacientes a menudo sufren una recidiva tumoral30, que se debe en gran medida a la heterogeneidad intratumoral31. La recaída a menudo es impulsada por el surgimiento de un mecanismo de resistencia al fármaco que hace que la eficacia de los fármacos individuales sea de corta duración32. Si bien los tratamientos con combinaciones de medicamentos ofrecen el potencial para reducir el riesgo de resistencia a los medicamentos, su predicción y evaluación empírica siguen siendo un desafío.

Para avanzar en la resolución de estos desafíos, presentamos aquí una tubería de microfluidos que permite pantallas de drogas combinatorias altamente multiplexadas en gotitas unicelulares utilizando transcriptómica global como lectura. Mediante la integración de códigos de barras deterministas de las condiciones de tratamiento, pudimos evaluar la eficacia de las combinaciones de fármacos mediante cambios en la expresión génica y obtuvimos lecturas completas de la secuenciación del transcriptoma completo. Aplicamos nuestra canalización para seleccionar 420 condiciones de tratamiento combinatorio en un solo tubo, lo que ilustra el alto nivel de multiplexación. Basado en la miniaturización del ensayo en un formato de gota, solo se necesitaron alrededor de 250 células por condición probada, lo que abrió el camino para las pantallas personalizadas directamente en el material del paciente y aumentó drásticamente la escala a la que se pueden realizar las pantallas combinatorias en líneas celulares u organoides derivados del paciente. y esferoides.

Hemos diseñado la plataforma de microfluidos como un sistema modular en el que las válvulas de visualización Braille nos permiten cambiar rápidamente entre los fármacos inyectados superando las limitaciones de una inyección lenta basada en un muestreador automático. Dado que ambos se combinan en el generador de gotas, la generación rápida y eficiente de combinaciones de fármacos se vuelve factible y permite la encapsulación de células individuales en gotas de alta diversidad química. Dado que el muestreador automático utilizado aquí inyecta fármacos de hasta tres placas de 96 o incluso 384 pocillos, el número de combinaciones de fármacos se puede ampliar aún más hasta un máximo teórico de 3 × 384 × 20 = 23 040 combinaciones en un solo experimento. Lo que se vuelve más limitante a esa escala son los costos de secuenciación y el material disponible (por ejemplo, cuando se usan celdas primarias) en lugar del rendimiento del instrumento.

Vemos un potencial adicional significativo en la posibilidad de examinar un número tan grande de combinaciones de fármacos a nivel de una sola célula: la integración de la clasificación de gotas basada en fluorescencia aguas arriba del paso de picoinyección (lisis celular) podría, por ejemplo, usarse para separar físicamente y secuenciar clones resistentes para las 420 opciones de tratamiento en un solo experimento (p. ej., implementando el ensayo fenotípico Caspase-3 que usamos anteriormente)14. De esta manera, se podría analizar la diferencia en su firma transcriptómica en comparación con las células que responden, abriendo el camino para estudios altamente multiplexados para revelar nuevos biomarcadores de resistencia y sensibilizadores (químicos) para superarlos. Como se demostró recientemente, las lecturas de una sola célula de la perturbación del fármaco proporcionan una gran comprensión de la respuesta heterogénea al fármaco11. Realizar tales pantallas en biopsias de pacientes nos permitirá diseccionar el impacto de la heterogeneidad del tumor en las respuestas a los medicamentos y, por lo tanto, definir combinaciones de medicamentos más eficaces y, además, obtener información sobre sus posibles mecanismos de resistencia. Para permitir la encapsulación de células tumorales primarias (o fragmentos microscópicos) y/o su expansión en esferoides, nuestro objetivo es integrar estructuras de soporte para la adherencia celular y el crecimiento en gotitas como se mostró anteriormente33,34.

Todos los conjuntos de datos generados demuestran que ni el enfoque del código de barras ni el modo de inyección sesgaron la lectura basada en la expresión génica. Las monoterapias de los modos de inyección y código de barras tuvieron impactos similares, mientras que sus combinaciones tuvieron el mayor impacto en la expresión génica y fueron el principal impulsor de la agrupación observada. Esto confirma la operación altamente precisa y precisa del flujo de trabajo de microfluidos presentado y la especificidad del enfoque de código de barras determinista. Además, encontramos similitudes significativas entre las firmas de expresión génica de consenso de las monoterapias de nuestra pantalla a gran escala con las firmas de fármacos del conjunto de datos LINCS-L1000, lo que ilustra un alto nivel de reproducibilidad. En el análisis de la actividad de la ruta, encontramos que la agrupación jerárquica fue impulsada en gran medida por los tres fármacos YM155, Imatinib y Trametinib, lo que respalda aún más la detección de efectos específicos de fármacos. Los dos grupos principales fueron impulsados ​​por los tratamientos con Trametinib que inhibían las actividades de las vías MAPK y EGFR, y los efectos opuestos de los tratamientos con YM155, que inducían las regulaciones al alza en las actividades de las vías MAPK y EGFR al tiempo que inhibían la hipoxia y las vías relacionadas con TRAIL. Si bien se esperan los efectos de Trametinib en MAPK35, los efectos de la inhibición de survivina por YM155 se conocen menos debido a la señalización compleja y al conocimiento incompleto sobre survinina36. Es probable que el aumento de la actividad de la vía MAPK refleje un mecanismo contrarrestante, ya que se describió que la expresión de survivina está regulada por la activación de Sp1 y c-Myc a través de la vía MAPK37, y una mayor concentración del objetivo del fármaco reducirá el efecto del fármaco. Dado que la expresión de survinina se ha relacionado con la resistencia a los medicamentos en la leucemia, el tratamiento combinado con YM155 y Trametinib podría tener un efecto potencialmente beneficioso en la disminución de las posibilidades de recaída, debido a la inhibición de la survivina y la supuesta expresión compensatoria inducida por la vía MAPK. En conjunto, estos hallazgos muestran que la canalización microfluídica descrita se puede aplicar para desentrañar los efectos de las combinaciones de fármacos en las actividades de la vía. Dicha información será de gran impacto cuando se evalúen biopsias de pacientes para identificar posibles mecanismos de resistencia y predecir pares de fármacos eficaces. El análisis de las actividades de la ruta tras las perturbaciones estuvo limitado por la cantidad de genes detectados y, por lo tanto, a las pantallas pequeñas de 4 × 4, ya que estas muestras se secuenciaron a mayor profundidad. Para detectar un número comparable de genes para las 420 combinaciones de fármacos, habría sido necesaria una cobertura diez veces mayor. En su lugar, utilizamos la pantalla grande para mostrar que los datos de secuenciación superficial son suficientes para determinar los pares de fármacos sinérgicos. Extrajimos el conjunto de datos con 420 condiciones de tratamiento para pares de fármacos con efectos sinérgicos o antagónicos. Descubrimos que la combinación de trametinib con inhibidores de la topoisomerasa 2 (Top2) (doxorrubicina o razoxano) tiene efectos antagónicos (Fig. 6b). Nuestra hipótesis es que la inhibición de la vía MAPK por parte de Trametinib y la detención del ciclo celular G1 resultante contrarresta el daño en el ADN que normalmente causa la inhibición de Top2 cuando las células entran en la fase S posterior. Entre las combinaciones sinérgicas predichas y validadas, encontramos la combinación de Triciribine con Dacarbazine y YM155 con Imatinib entre los principales éxitos (Fig. 6b). BCR-ABL (el objetivo de Imatinib) se ha relacionado previamente con la regulación positiva de la expresión de survivina (el objetivo de YM155)38. Por lo tanto, se descubrió que el silenciamiento antisentido de survivina reduce la viabilidad y aumenta la eficacia del tratamiento con imatinib en líneas celulares de leucemia mieloide crónica (LMC), así como en progenitores mieloides de pacientes con LMC39,40. Al confirmar una combinación de tratamiento eficiente para la LMC descrita anteriormente, que tiene el potencial de prevenir la aparición de resistencia a imatinib, ilustramos aún más el potencial de nuestra cartera en la identificación de pares de fármacos clínicamente relevantes. Además, validamos que existe una buena correlación entre las puntuaciones de viabilidad de los datos de expresión génica y las puntuaciones de sinergia validadas experimentalmente obtenidas de la pantalla de drogas basada en placas. Estos resultados muestran que es posible utilizar una profundidad de secuenciación baja rentable en pantallas transcriptómicas grandes para descubrir pares de fármacos sinérgicos.

Junto con las actividades de la vía inferida bajo perturbación, esto no solo debería permitir la identificación de combinaciones sinérgicas, sino también obtener información sobre sus mecanismos de acción. En comparación con nuestra plataforma14 de ensayo fenotípico de medición única anterior, la lectura transcriptómica global proporciona más puntos de datos por muestra en órdenes de magnitud, mientras que el consumo de células podría reducirse aún más en un factor de aproximadamente seis veces. Las lecturas de mayor contenido deberían permitir predicciones más sólidas sobre los mejores tratamientos combinatorios y el descubrimiento de nuevos sensibilizadores de fármacos y biomarcadores, y las necesidades aún más pequeñas de material facilitan aún más la aplicación en la clínica para la estratificación de pacientes y la priorización de tratamientos.

Todos los dispositivos utilizados para el módulo de válvulas se replicaron a partir de moldes preparados mediante litografía blanda con fotoprotector positivo AZ-40XT (microquímicos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se modelaron estructuras de fotomáscaras de 25400 ppp (Selba) en obleas de silicio de 4 pulgadas (Siltronix) en un alineador de máscaras (Suess MicroTec MJB3) usando luz con una longitud de onda de 375 nm. Las estructuras se cubrieron con una capa de ~1 cm de espesor de PDMS mezclada con un agente de curado en una proporción de 1:10 (kit de elastómero Sylgard 186, Dow Corning Inc) y se curaron durante la noche a 65 °C. Además, preparamos membranas de PDMS mezclando PDMS con un agente de curado en una proporción de 1:10 y distribuyéndolo sobre una lámina transparente utilizando un recubridor giratorio a 500 rpm (Laurell WS 650), que se curaron durante la noche a 65 °C. Los puertos de entrada y de desecho del fármaco del chip de la válvula se perforaron con punzones de biopsia de 0,75 mm (Harris Unicore), mientras que el puerto de salida del tapón se perforó horizontalmente a los canales de salida con un punzón de biopsia de 0,5 mm (Harris Unicore). Los chips se unieron a una membrana de PDMS utilizando un horno de plasma (Diener Femto). Insertamos tubos de PTFE con un diámetro interior de 0,4 mm (Adtech) en el puerto de salida perforado horizontalmente hasta que el tubo alcanzó la estructura en forma de embudo del canal de salida. Posteriormente, los chips se unieron a un portaobjetos de vidrio para soportar estructuras de chips con entradas y salidas. Para evitar la humectación de la superficie, los canales se trataron con Aquapel (PGG Industries) antes de su uso. Las estructuras de válvula de los chips Braille se alinearon (Fig. 2a complementaria) sobre los pines de una pantalla Braille (KGS Corporation, Fig. 21a complementaria) y se montaron con un soporte de plexiglás (Fig. 21b complementaria). Utilizando nuestro software "CombinatorialPlugFluidics" LabVIEWTM 2013 (todo el software necesario se puede descargar desde www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads). se controló el movimiento de los pasadores, de forma que al abrir el canal de recogida se producía el cierre del canal de residuos y viceversa. El cierre de un canal se logró presionando un alfiler en la membrana elástica de PDMS. Esto podría abrirse nuevamente moviendo el pasador hacia abajo. Para todos los experimentos, usamos 20 jeringas (Becton Dickinson) llenas con 5 ml de soluciones de códigos de barras de fármacos y cuatro jeringas llenas con 5 ml de aceite HFE (Novec™ 7500, 3 M). Estos se conectaron a los puertos de entrada del chip de la válvula con tubos de PTFE y los fluidos se inyectaron a 500 µl h−1 utilizando bombas de jeringa (aparato de Harvard). Las salidas de desechos estaban conectadas con una pieza de tubería de PTFE para dirigir los fluidos a un contenedor de desechos.

Los moldes para hacer gotas se fabricaron a partir de fotorresistencia negativa SU-8 2075 como describe el fabricante (Microchemicals). Se vertió PDMS que contenía un agente de curado al 10 % (p/p) sobre los moldes y se curó durante la noche. Los puertos de entrada para las células y el HFE se punzonaron verticalmente con punzones de biopsia de 0,75 o 1 mm para los tubos de PEEK procedentes de la conexión del inyector automático. Los puertos de entrada para los tapones compuestos de las válvulas Braille se perforaron horizontalmente con punzones de 0,5 mm. Los chips se unieron primero con plasma a una membrana de PDMS y, posteriormente, a un portaobjetos de vidrio. La hidrofobicidad de la pared del canal se incrementó mediante la inyección de Aquapel (PGG Industries) en los canales.

Para facilitar la inyección de fármacos de placas de microtitulación en el dispositivo de fabricación de gotas, utilizamos un inyector automático Dionex 3000SL que aspira fármacos de una placa de 96 pocillos. El muestreador automático se programó para aspirar secuencialmente 310 µl del compuesto de los pocillos en un bucle de muestra de 125 µl. El gran exceso de volumen aspirado representó un volumen de aguja de 60 µl y un factor de sobrellenado del bucle de 2. Al sobrellenar el bucle de muestra al doble de su volumen, nos aseguramos de que la mezcla del compuesto restante no se diluyera con los fluidos portadores que quedan en el bucle de muestra después de cada ciclo debido al lavado. La inyección de compuestos del bucle de muestra en el generador de gotas fue impulsada por una bomba de jeringa (aparato de Harvard) que inyectó PBS (Thermo Fisher) a 500 µl h−1. Después de la aspiración de un fármaco, comenzó un tiempo de demora para asegurar que cada fármaco se inyectara y combinara con todos los fármacos de la pantalla Braille antes de que se aspirara el siguiente fármaco.

Se generaron secuencias aleatorias de ADN de 10 nt de longitud con distribuciones de bases equilibradas utilizando la herramienta bgen (gear.embl.de). Los cebadores de PCR con código de barras se funcionalizaron con biotina en el extremo 5′ para la purificación, seguidos de una secuencia espaciadora, una secuencia de cebador común, una secuencia de código de barras única y un sitio de ligadura (Tabla 2). Los complementos inversos (RC) se funcionalizaron con un fosfato libre en el extremo 5' para permitir la ligadura. Los cebadores de RT con código de barras comprendían una secuencia dT(20)-VN, una secuencia de código de barras única y un grupo fosfato en el extremo 5′. El RC para esto tenía un sitio de ligadura complementario al sitio de ligadura de los cebadores de PCR. Puede encontrar una lista de todas las secuencias de códigos de barras en los materiales complementarios. Las secuencias complementarias se recocieron a concentraciones equimolares calentando las mezclas a 95 °C durante 10 min en un bloque térmico (Eppendorf) seguido de su enfriamiento a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.

Las mezclas de código de barras y fármacos para el módulo de válvula se prepararon diluyendo cebadores RT con código de barras en medio FreeStyle (Thermo Fisher) a 1 µM. Los medicamentos disueltos en DMSO se agregaron a su código de barras correspondiente a 2x las concentraciones finales (ver materiales complementarios). Las mezclas de código de barras y fármacos se complementaron con Cascade-Blue (Thermo Fisher) o Alexa-488 (Thermo Fisher) a 10 µM con fines de control y, posteriormente, se aspiraron en jeringas luer-lock (BD) de 5 ml conectadas con tubos de PTFE usando 27 G Agujas ¾ (BD). Las mezclas de fármacos y códigos de barras para la inyección basada en el muestreador automático se prepararon en placas de 96 pocillos de fondo redondo diluyendo cebadores de PCR con códigos de barras a 4 µM en medios FreeStyle y los fármacos correspondientes a 4x las concentraciones finales. Las mezclas se complementaron con Alexa-488 a 10 µM y las placas se sellaron con sellos adhesivos qPCR (Thermo Fisher).

Las células K562 (ATCC, CCL-243) se cultivaron en medio IMDM (Thermo Fisher) complementado con FBS al 10 % (Thermo Fisher) y penicilina-estreptomicina al 1 % (Thermo Fisher). El día de los experimentos, las células se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en FreeStyle Media (Thermo Fisher) suplementado con FBS al 4 %. La concentración de la suspensión celular se ajustó a 2 × 106 células ml−1 y posteriormente se aspiró en una jeringa luer-lock (BD) de 3 ml.

Las jeringas que contenían mezclas de código de barras de fármacos y aceite HFE se conectaron al chip de válvula Braille como se muestra en la Fig. 1c y se inyectaron a 500 µl h−1. El modo predeterminado para todas las válvulas compuestas era dirigir los fluidos a las salidas de desechos y dos válvulas de aceite HFE para dirigir los fluidos a la tubería de salida. La longitud de la tubería de salida de la válvula Braille se ajustó para albergar los 20 tapones compuestos espaciados con aceite HFE y luego se conectó a la entrada Braille en el chip marcador de caída (Figura complementaria 21b). Se montó una jeringa que contenía células en una bomba y se conectó al fabricante de gotas y se inyectó a 500 µl h−1. La sedimentación celular se evitó mediante rotaciones a baja velocidad del disco magnético usando el sistema Multi Stirrus™ (VP Scientific). Los tubos de salida del muestreador automático y la fase portadora de HFE complementada con Pico-Surf1 al 1 % (Sphere Fluidics) se conectaron a través de las entradas respectivas y se inyectaron a 500 y 6000 µl h−1, respectivamente. El chip fabricante de gotas se montó en un microscopio (Nikon, Eclipse Ti2-E) con una configuración óptica para medir las intensidades de fluorescencia de los tapones compuestos o las gotas14. Se usaron láseres con una longitud de onda de 375 o 488 nm para excitar los tintes y la luz emitida (450 o 520 nm) se midió usando tubos fotomultiplicadores. Los láseres se enfocaron en una de las tres posiciones (M1–M3) que se muestran en la Fig. 1c para medir los tintes fluorescentes que se inyectaron junto con las mezclas de código de barras y medicamento en el fabricante de gotas. En las posiciones M1 y M2, las señales de fluorescencia se registraron utilizando el software PlugAcquisition LabViewTM 2014. Las señales de fluorescencia de las gotas se adquirieron en la posición M3 utilizando el software DropletAcquisition LabViewTM 2014 (todo el software necesario se puede descargar desde www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads).

Se cargó un archivo CSV que contenía la secuencia de apertura de la válvula en Braille (Tabla 3) en el software de muestra bajo demanda. El número de ciclos se fijó en 21 ya que estábamos combinando los 20 medicamentos de las válvulas Braille con 21 medicamentos de una placa de 96 pocillos. Una vez que se conectaron todos los tubos y se inyectaron los fluidos en el marcador de gotas (fluido portador del muestreador automático y aceite HFE de las válvulas Braille), la producción de tapones y la inyección basada en el muestreador automático se iniciaron simultáneamente. Se produjeron 20 tapones en el tubo de retardo (180 s) y posteriormente se inyectaron en el generador de gotas, abriendo dos válvulas de aceite HFE (tasa de flujo total de 1000 µl h−1). Esto garantizó una velocidad de flujo continua y estable para las inyecciones de tapón y, por lo tanto, dio como resultado un flujo laminar de compuestos de las válvulas Braille, compuestos del muestreador automático y celdas a partir de las cuales se generaron gotas en la unión de enfoque de flujo (Película S1). Se recogieron gotitas de ~800 µl en un tubo Eppendorf que se mantuvo en hielo. Una vez que se generaron 420 combinaciones (~100 min), el tubo Eppendorf se colocó en una incubadora humidificada a 37 °C y una atmósfera de CO2 al 5% para incubar las células durante 12 h.

Los chips para picoinyección se produjeron replicando moldes SU-8 utilizando PDMS con un agente de curado como se describe anteriormente. Los moldes se unieron con plasma a portaobjetos de vidrio y se trataron con Aquapel. Los chips se calentaron a 95 ° C, y la primera soldadura de bajo punto de fusión y los segundos cables se insertaron en los puertos para los dos electrodos (Fig. 22 complementaria). El chip se montó en el microscopio de una estación de microfluidos y el electrodo de potencia se conectó a un amplificador de alto voltaje, mientras que el chip se conectó a tierra sobre el electrodo de puesta a tierra.

Después de una incubación de 12 h, las gotas que contenían células, combinaciones de fármacos y códigos de barras de ADN correspondientes se transfirieron a una jeringa de 3 ml y se inyectaron a través del puerto de entrada de gotas en un chip de picoinyección (Fig. 2 complementaria). Las gotas se enjuagaron a 180 µl h−1 y las gotas individuales se espaciaron inyectando aceite HFE con tensioactivo PicoSurf al 1% a 700 a 1000 µl h−1 sobre la entrada de aceite. Para la lisis celular, la ligadura de códigos de barras y la transcripción inversa del ARNm liberado de las células lisadas, inyectamos pico en una mezcla de reacción de un recipiente que contenía 0,9 % de Igepal (Sigma Aldrich), tampón de ligadura 3x (NEB), 60 000 U/µl de ligasa T4 ( NEB), dNTP 1,5 mM (Thermo Fisher), oligonucleótido de cambio de plantilla (IDT) 7,5 µM, 12 U/µl de transcriptasa inversa Maxima -H (Thermo Fisher) y 6000 U/µl de inhibidor de RNasa NxGen (Lucigen). Los caudales de la mezcla de reactivos se ajustaron según la frecuencia y el tamaño de las gotas para inyectar el equivalente a 1/3 del volumen final de las gotas (Película S3). Para lograr la inyección de reactivos en las gotas que pasan por la boquilla del inyector, se aplicó un campo eléctrico continuo de 0,1 V mediante un generador de funciones (Rigol). La picoinyección se realizó durante ~ 1 h durante la cual todas las gotas (inyección y recolección) se mantuvieron en hielo. Posteriormente, la emulsión se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min y luego se incubó durante 90 min a 42 °C.

Los experimentos de intercambio de fármacos se realizaron como las pruebas de detección combinatorias de fármacos descritas con pequeñas adaptaciones: los diferentes fármacos solo se inyectaron desde el muestreador automático, mientras que solo los medios suplementados con BC-15 o BC-O y DMSO se inyectaron continuamente desde la entrada braille, utilizando una jeringa normal. bomba en lugar de la pantalla braille. Las emulsiones de todas las muestras se recogieron en pocillos individuales de placas de 96 pocillos, se incubaron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera con un 5 % de CO2, se agruparon y luego se procesaron como se describe para los análisis de fármacos combinatorios.

En primer lugar, se añadieron 10 µl de BC-PCR y 5 µl de BC-RT, ambos 20 µM, a los pocillos respectivos de una placa de 96 pocillos, seguidos de 4 µl de uno de los correspondientes stock de 50 veces el fármaco de Imatinib, Trametinib , o YM155 (Tabla S4). Las células K562 se resuspendieron en medio FS con FBS al 1 % (peso/vol) hasta una concentración de 1050 células/µl. Para cada pocillo que contenía la mezcla de fármacos y códigos de barras, se añadieron 181 µl de esta suspensión celular y luego se incubaron a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO2 durante 12 h. Para aumentar la eficiencia, primero se realizó la lisis celular y la ligadura, seguidas de los pasos de purificación y lavado, antes de llevar a cabo la transcripción inversa. En particular, se transfirieron 20 µl de células a un pocillo que contenía 10 µl de Igepal al 0,9 % (Sigma Aldrich), tampón de ligación 3x (NEB), 60 000 U/µl de ligasa T4 (NEB) y 6000 U/µl de inhibidor de ARNasa NxGen. (Lucigen) para la lisis celular (10 min en hielo) y ligadura de código de barras (30 min a temperatura ambiente). Se agregaron aproximadamente 200 µl de 6x SSC a las mezclas antes de transferirlas a tubos Eppendorf de 1,5 ml para centrifugar a 2000×g durante 5 min. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos Eppendorf frescos suplementados con 50 µl de C1 dynabeads a 10 µg µl−1 en tampón SSC 6x y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en un nutator (VWR). Las perlas se lavaron tres veces en tampón SSC 6x, se centrifugaron brevemente en una centrífuga de sobremesa y luego se resuspendieron en 80 µl de mezcla de transcripción inversa, que contenía tampón Maxima RT 1x (Thermo Fisher), 4% Ficoll-PM 400 (Sigma Aldrich), 1 dNTPs mM, 2000 U/µl de inhibidor de RNasa NxGen (Lucigen), 2,5 µM de oligonucleótido de cambio de plantilla (IDT) y 4 U/µl de transcriptasa inversa Maxima-H (Thermo Fisher). Las mezclas se incubaron bajo nutación (VWR) durante 30 min a temperatura ambiente y durante 90 min a 42 °C. Las perlas se lavaron dos veces en TE-SDS (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM y SDS al 0,5 %) y dos veces en agua libre de nucleasas (Thermo Fisher) antes de que el ADNc de diferentes condiciones se agrupara y procesara para preparaciones de bibliotecas como se describe en la sección "Preparación y secuenciación de bibliotecas".

Las células K562 se cultivaron como se describe en la sección "Preparación de suspensiones celulares". El día de los experimentos, las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en FreeStyle Media (Thermo Fisher)", complementado con FBS al 1 %. Para comparar las estrategias de captura de ARN basadas en Combi-seq y PolyA, se transfirieron 250 células/μl a un tubo Eppendorf y se mezcla con una solución de 5 μl, que contiene los fármacos correspondientes o DMSO, junto con códigos de barras Combi-Seq o PolyA-Seq suspendidos en FreeStyle Media, 1% FBS Después de 16 h de incubación a 37 °C y 5% de atmósfera de CO2, las células se mezclaron con 15 μl de la solución que contenía tampón de lisis, ligasa y transcriptasa inversa como en el experimento de gotas (consulte la sección "Picoinyección para lisis celular, ligadura de código de barras y transcripción inversa" para obtener más detalles).

Los agregados de ERCC (Thermo Fisher, Cat No. 4456739) se diluyeron a 1:100 en agua libre de ARNasa. Luego, se agregaron 30 μl de los suplementos de ERCC diluidos a un total de 600 μl de la mezcla de reacción de un recipiente. Esta mezcla de reacción se picoinyectó en una proporción de 1:3 a una gota como se describe en la sección "Picoinyección para lisis celular, ligadura de código de barras y transcripción inversa".

Tras la transcripción inversa del ARNm, todo el ADNc se codificó según los tratamientos farmacológicos y, por lo tanto, rompimos la emulsión añadiendo de 0,5 a 1 ml de 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol (Abcr). El sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo, se complementó con 1x el volumen de C1 dynabeads (Thermo Fisher) a 2,5 µg µl−1 en tampón SSC 6x (Thermo Fisher) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. Las perlas se lavaron 2 veces en TE-SDS (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM y SDS al 0,5 %) y 2 veces en agua libre de nucleasas (Thermo Fisher). Las perlas se resuspendieron a 5 µg µl−1 seguido de digestión con MseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sobrenadante se purificó 2 veces usando perlas SPRIselect (BD), primero a 0,6x y luego a 0,8x el volumen de cDNA, y finalmente se amplificó en KAPA HiFi ready mix (Roche) con 0,8 µM de cebador SMART (Tabla complementaria 3) durante un total de 13 ciclos (programa PCR en la Tabla complementaria 4). Los productos se purificaron en 0,6 veces el volumen de perlas SPRIselect y luego se analizaron utilizando chips de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer 2100 (Agilent). Se realizó la fragmentación del ADNc para acortar los fragmentos e introducir secuencias conectoras. Esto se logró utilizando un protocolo de tagmentación basado en Tn5 para bibliotecas de extremo 3 'desarrollado en house41. Los fragmentos se amplificaron con un cebador P5-SMART (Tabla complementaria 3) y cebadores adaptadores P7 indexados i7 (Illumina, Tabla complementaria 3) a 0,75 µM en KAPA HiFi ready mix (programa PCR, Tabla complementaria 4). Los fragmentos se purificaron en 1x el volumen de perlas SPRIselect y las distribuciones de tamaño se determinaron usando un Bioanalizador. Todas las réplicas se agruparon en proporciones equimolares y se secuenciaron en una máquina NextSeq 500 (Illumina) junto con 10 % de complementos PhiX. La secuenciación de extremos emparejados se realizó mediante la secuenciación de la combinación de código de barras (Lectura 1, 26 pb) utilizando el cebador personalizado de secuenciación (Tabla complementaria 3) y el ARNm (Lectura 2, 59 pb).

En los diagramas de caja, la línea central representa la mediana medida, y las bisagras de la caja superior e inferior corresponden al primer y tercer cuartil. Los bigotes que se extienden desde las bisagras superior e inferior de la caja representan el rango intercuartílico de 1,5 veces. Los puntos con las líneas que se muestran en el diagrama de violín en la Fig. 2d corresponden a la media con desviación estándar para cada una de las contaminaciones cruzadas medidas.

Utilizamos el SCANPY pipeline42 para el preprocesamiento de la expresión génica y el control de calidad. Se filtraron las muestras con un bajo recuento de genes y una alta proporción de genes mitocondriales (>15 por ciento) y genes con una alta tasa de deserción. Los recuentos de lectura se normalizaron en función de la profundidad de secuenciación y la puntuación z transformada. El efecto de lote (réplicas) se eliminó usando la función de combate de SCANPY. Para la reducción de dimensiones, utilizamos el análisis de componentes principales, seguido de la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (TSNE)43. Se realizaron análisis de datos adicionales en scripts personalizados de Python 3.7 utilizando NumPy44 y pandas como bibliotecas de modelos estadísticos.

Para analizar la agrupación de muestras en función de los diferentes factores (medicamento del muestreador automático, medicamento de válvulas Braille, combinación), utilizamos el análisis de puntuación de silueta. Se calculó el coeficiente de silueta (b - a)/max(a,b) para cada muestra, donde a era la media intra- y b era la distancia media del racimo más cercano. Para cada factor de agrupación, se calculó el promedio de los coeficientes de silueta (biblioteca Python scikit-learn). Como la puntuación de la silueta depende del número de conglomerados, creamos conglomerados aleatorios permutando las etiquetas de las muestras, por lo tanto, la pertenencia al conglomerado.

Las actividades de la ruta se calcularon utilizando el método PROGENy17,18,19. Las actividades de las vías específicas de cada fármaco se calcularon ajustando un modelo lineal (pathway_activity ~ YM155 + Imatinib + Trametinib).

Para comparar la similitud entre las firmas de expresión génica de la pantalla de alto rendimiento y el conjunto de datos LINCS-L10008, calculamos las firmas de consenso para cada fármaco de la pantalla de alto rendimiento. Para calcular las firmas de consenso, ajustamos un modelo lineal (gene_expression ~ Drug1 + Drug2 + … + Drugn) para cada gen de la matriz de expresión y usamos los coeficientes del modelo lineal como firmas específicas de las drogas. Para comparar las similitudes de las firmas, calculamos el coeficiente de correlación de rango de Spearman entre las firmas de fármacos de la pantalla de alto rendimiento y las firmas LINCS-L1000. Los valores de similitud se usaron como valores predichos para el análisis ROC, mientras que los verdaderos positivos fueron los pares de fármacos coincidentes entre la pantalla de alto rendimiento y LINCS-L1000.

Para las predicciones de viabilidad celular se utilizó el método CEVIChE. CEVIChE predice la viabilidad celular a partir de cambios en la expresión génica basándose en un modelo lineal, entrenado en una gran compilación de datos de viabilidad celular y expresión génica emparejados18. Como los genes medidos de la pantalla de alto rendimiento mostraron poca superposición con los genes utilizados por el modelo CEVIChE original, volvimos a entrenar a CEVIChE usando solo los genes medidos en la pantalla de alto rendimiento. Este modelo CEVIChE reentrenado mostró un rendimiento comparable (correlación de Pearson entre la viabilidad celular predicha y observada: 0,31) al método original.

Las placas de fármaco se prepararon con antelación en un tablero de ajedrez de 4 × 4 para cada combinación, de modo que después de la adición de células, cada fármaco estuviera presente en su concentración de GR35 y una serie de diluciones cuádruples del mismo. Cada placa también contenía medios y controles negativos de DMSO y monoterapias para cada fármaco. Las células K562 se pasaron el día antes de cada experimento. El día del experimento, las células se lavaron una vez con PBS y luego se resuspendieron en medio FreeStyle 293 (Thermo Fisher), que contenía FBS al 1%. Las células se añadieron mediante la función de varios pasos de una pipeta multicanal a cada placa de fármaco preparada previamente, de modo que cada pocillo tuviera un volumen final de 200 µL y ~2 × 104 células. El depósito del que aspirar las células se rellenó con frecuencia con una solución madre recién resuspendida para garantizar que las células permanecieran en suspensión. Las placas se sellaron con una lámina permeable a los gases (Sigma) y se incubaron durante 48 h. Para evitar la evaporación, las placas se mantuvieron en la incubadora dentro de una caja con ~1 cm de agua, dentro de la caja, las placas descansaban sobre cajas de puntas. Después de la incubación, se añadieron 22 µl de reactivo de viabilidad celular PrestoBlue (Thermo Fisher) a cada pocillo, y las placas se volvieron a sellar y se devolvieron a la incubadora durante 1 h. A continuación, las placas se leyeron utilizando un lector de microplacas Tecan con longitudes de onda de excitación/emisión de 535/615 nm (ancho de onda de 20 y 10 nm, respectivamente). Con base en la viabilidad celular medida para las monoterapias, calculamos las viabilidades celulares esperadas utilizando el modelo de independencia de Bliss24 para cada combinación, para cada par de concentraciones. La diferencia entre la viabilidad celular esperada y medida para las combinaciones se promedió en todas las concentraciones y se proporcionó como una puntuación de sinergia.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación de ARN generados en este estudio se han depositado en la base de datos GEO con el código de acceso GSE174696. Los datos espectrométricos de fluorescencia adquiridos en las estaciones de microfluidos y las mediciones de viabilidad de las células en las placas generadas en este estudio se proporcionan en el archivo de datos de origen. Los valores logD de los fármacos utilizados en este estudio están disponibles en la base de datos ChEMBL45. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El software de control de microfluidos se puede descargar desde www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads. Los archivos CAD para los chips de microfluidos están disponibles en Zenodo: https://zenodo.org/record/6845607#.YtWZlMFBz1K. El código utilizado para analizar los datos transcriptómicos se puede descargar desde https://github.com/saezlab/Combi-Seq-analysis46.

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Agradecemos a todos los miembros de Genomics Core Facility en EMBL por su ayuda en la preparación de bibliotecas y la secuenciación de nuestras muestras, al taller electrónico y mecánico de EMBL por construir controladores y soportes para las válvulas Braille, al SIM de EMBL por mantener el alineador de máscara, a Bart Deplancke y a Cathrin Brisken por sus comentarios sobre el manuscrito, y a todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio de Merten por sus discusiones y comentarios. BS agradece al Programa de Becas Premium de la Academia Húngara de Ciencias (460044).

B. Szalai

Dirección actual: Turbine Simulated Cell Technologies Ltd, Budapest, Hungría

Estos autores contribuyeron igualmente: L. Mathur, B. Szalai.

Unidad de Biología del Genoma, Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), Heidelberg, Alemania

Mathur L, Uthala R, Ballinger M, Landry JJM, Benes V y Merten CA

Colaboración para un doctorado conjunto entre EMBL y la Universidad de Heidelberg, Facultad de Biociencias, Heidelberg, Alemania

L. Mathur

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad Semmelweis, Budapest, Hungría

B. Szalai

Instituto de Enzimología, Centro de Investigación de Ciencias Naturales, Budapest, Hungría

B. Szalai

Instituto de Bioingeniería, Escuela de Ingeniería, Instituto Federal Suizo de Tecnología (EPFL), Lausana, Suiza

NH Du y CA Merten

Universidad de Estrasburgo, CNRS, Arquitectura y Reactividad del ARN, UPR, 9002, Estrasburgo, Francia

M. Ryckelynck

Facultad de Medicina y Hospital Universitario de Heidelberg, Instituto de Biomedicina Computacional, Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania

J. Saez-Rodriguez

Facultad de Medicina, Centro Conjunto de Investigación de Biomedicina Computacional (JRC‐COMBINE), Universidad RWTH Aachen, Aachen, Alemania

J. Saez-Rodriguez

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LM conceptualizó y desarrolló la plataforma microfluídica y el enfoque de código de barras, diseñó y realizó experimentos y analizó los datos bajo la supervisión de CAMBS ideó y realizó el análisis computacional de los datos bajo la supervisión de JS-RNHD diseñó y realizó experimentos y analizó los datos. RU escribió el software LabVIEW utilizado para la plataforma de microfluidos. MB realizó experimentos de validación basados ​​en placas. JJML procesó los datos de secuenciación bajo la supervisión de VBMR y apoyó el desarrollo de los procedimientos de picoinyección. LM y BS interpretaron los resultados y escribieron el manuscrito con la ayuda de NHD, CAM y JS-R. revisó y editó el manuscrito.

Correspondence to J. Saez-Rodriguez or C. A. Merten.

LM, RU y CAM son inventores de solicitudes de patentes que cubren la estrategia de códigos de barras y los métodos de microfluidos descritos aquí (WO2016207441A1). JS-R. ha recibido financiación de GSK y Sanofi y honorarios de consultoría de Travere Therapeutics y Astex Pharmaceuticals. BS es un empleado de tiempo completo de Turbine Ltd., Budapest, Hungría. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Jeremy Jenkins, Angela Wu y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Mathur, L., Szalai, B., Du, NH et al. Combi-seq para perfiles basados ​​en transcriptomas multiplexados de combinaciones de fármacos utilizando códigos de barras deterministas en gotitas unicelulares. Nat Comun 13, 4450 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

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Recibido: 26 mayo 2021

Aceptado: 21 de julio de 2022

Publicado: 01 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

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